《科学》：即时检验迎来革命性突破 2 小时内判断病毒种类

本周，《科学》杂志以封面形式发表了一项有关 CRISPR 技术的最新进展。此前我们曾经报道过，张锋团队构建的“SHERLOCK”检测技术，该技术利用 CRISPR/Cas13a 系统，在病毒快速检测领域迈出了一大步。这项备受期待的技术，这次又迎来了新的重大突破，终于可以离开实验室，有望在疾病一线大显身手了！

《科学》本周封面

本项研究引入了一种新的样品处理方法，告别了实验室内繁复的核酸提取工作，使得新技术能够直接在患者唾液和血清样本中检测到病毒，同时依旧保持着 1 个拷贝 / 微升的灵敏度。该技术也能够更容易、快速地区分几种相关的类似病毒（如寨卡、登革热、黄热病毒和西尼罗河病毒），这些病毒引起的症状相似，对辨明疫情特别有用！[1]

基于此前研究的基础，检测结果可以直观地展示在试纸上，整个过程只需要不到 2 个小时。这意味着，不需要复杂的设备，不需要高端的技术人员，在疫情来临时，普通的医务人员即可在现场快速确认毒株！

在上一季度大热的日剧《非自然死亡》的第一集中，出现了这样的剧情：身为法医的女主角，发现死者有感染中东呼吸综合征（MERS）的可能性，为了确认是否存在病毒，急切寻求有相关技术设备和人员企业的帮助。

许多大规模传染病都面临着检测难的问题。

2015 年 -2016 年间，疯狂肆虐的寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV），本身传播快、滴度低，受限于检测技术，确诊第一例病例时，疫情已蔓延了几个月。而寨卡与登革热（Dengue Virus，DENV）这类相似的病毒，往往造成的症状也很类似，区分更是难上加难 [2]。

基于核酸的检测方法，确实具有足够的敏感性，检测速度也够快，但往往需要大量的样本和昂贵的设备 [2]；抗原检测倒是对设备要求不高，但是特异性差了些，过程更是漫长[3]。

无论是不是这些传播极快、疫情严重的疾病，理想的检测方法都应该兼顾敏感性和特异性，速度要快，费用要低，最好能够同时比对多个对象，同时对设备、技术、资源的要求也要尽可能低。

颇受关注的 CRISPR 小王子张锋，于去年首次发表了 SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）技术，这项技术基于 CRISPR/Cas13a 系统，并结合重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），能够对样本中痕量的核酸在恒温条件下进行大量扩增，从而满足 Cas13a 的检测需求 [4]。

SHERLOCK 的作用机制

这里再介绍一下 Cas13a。它是一种 RNA 酶，与我们比较熟悉的乖巧的 Cas9 不同，Cas13a 比较癫狂，对它来说完成靶向 RNA 序列的切割根本不是工作的终点，而是狂欢的开始，本来一个安安静静的酶就开始随意切割其他不相干的 RNA 了。因为这种乱切一气的态度，最开始科学家也没觉得能拿它来干嘛。

要不怎么说创意值千金呢，利用它这个奇葩特点，配合上一个被切断就会荧光的“报告 RNA”，化“切割”为“检测”，这只捣蛋鬼也在 SHERLOCK 技术里找到了自己的一席之地。

两个月前，张锋团队对 SHERLOCK 进行了再一次升级，提出了“Version2”。V2 版结合了其他的 Cas 酶，实现同时检测 4 种不同类型的病毒或者突变，而且信号灵敏度也大大提高 [5]。

正是在这一版里，科学家们开发出了对应的试纸条，能够直接用肉眼观察结果！这种亲眼看到 CRISPR 的感觉还蛮激动的！

不得不说，SHERLOCK 在各种方面来看，都是一种很有希望实现“理想”的技术，面临的问题，就是它还不能完全离开实验室，比如检测需要的样本，依旧需要在实验室内进行制备。这就是今天这项研究要解决的问题。

SHERLOCK 技术的快速发展，是张锋一手带领的，但是今天这项研究却并不是由张锋主导的。虽然张锋也名列作者之一，但是本文的通讯作者其实是另一位读者可能不太熟悉的杰出科学家，同在 Broad 研究所任职的生物信息学家 Pardis Sabeti。

当埃博拉病毒在西非开始流行的时候，Sabeti 教授做了一件非常重要的事：她的团队几乎在疫情爆发第一时间就对来自感染者的病毒样本进行了测序，从 DNA 数据中清楚确定了病毒传播的途径。参与这项工作的许多科学家在这次疫情中感染死亡，但换回了更多生命。她因此被评为《时代周刊》2014 年度人物，当之无愧的“埃博拉斗士”。

女科学家真是美炸了！

在本项研究中，Sabeti 教授带来了一种新的样本处理技术，HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）。从名字也可以看得出来，HUDSON 技术是一种基于热处理的技术，对未处理的样本进行快速的热处理和化学处理，除去导致病毒核酸降解的核酸酶（RNase），同时溶解病毒衣壳，把核酸释放到样品里。

经过“哈德逊太太”处理过的样本，直接让“夏洛克”检查，不到两个小时就能在试纸上看到结果了！

HUDSON 的作用机制

所谓样本都包括什么呢？全血、血浆、血清、尿液、唾液，这些都可以。实际上尿液和唾液取得方便而且对人体无创，也是研究者的主要研究目标。

我们都懂得样品条件对检测结果的重要性，就算制备简便，但如果要牺牲敏感性也是得不偿失。好在 HUDSON 和 SHERLOCK 都没让研究者失望，在多种样品内对不同浓度的病毒进行检测，高效一如既往，灵敏度保持在阿摩尔级，能够检测出 1μl 内的单个分子，而且保证了 100% 的特异性和一致性。

灵敏度达到 aM 级

对相似病毒和不同血清型的分辨率也很令人满意。研究者检测了几种导致类似症状的黄病毒，新技术的脱靶率<0.22%；分辨不同血清型的登革热病毒（DENV），脱靶率也 <3.2%，足够以 100% 特异性分辨目标。

寨卡、登革热、西尼罗河病毒、黄热病毒，统统不是问题

这些可恶的恶性病毒带来的另一个麻烦就是，它们在传播过程中会不停地突变，进化出越来越多的技能，比如耐药性，比如更强的毒性，又比如传播得更快的能力。就拿寨卡举例，孕妇感染了寨卡病毒，很可能会造成肚子里的小宝宝出现小头畸形，这就与寨卡病毒的 S139N 突变有关 [6]。

针对这类发生在单个核苷酸中的突变，SHERLOCK 也是能够一展身手的，具体细节不说了，以前的文章也报道过。就问你，一周测出来，快不快！

使用样本来自患者

目前，新技术检测需要用到的所有试剂，均可以制作成冻干粉剂，在保存条件上要求并不严苛，想必未来这些小瓶子小纸条就可以跟随前线的医师们深入疫区，挽救更多的生命。

Sabeti 教授在新闻稿中说道，“新技术让我们能够更快、更容易地诊断患者，并且这个技术可以带到任何地方使用。”“技术的每一次改进都会减少必需的设备，我们正在努力让它更好更容易用，这是患者真正需要的。”[7]

本项研究的第一作者 Freijie 也表示：“在南美洲这样的地方，很多类似的病毒都在同时流通，可能会造成误诊，快速分辨出它们之间的差异是很重要的。使用这种新型的检测方法，患者只要给出一份血液或者尿液样本，几次反应就能够分析出包含的病毒，然后患者就能够得到正确的治疗。”

Broad 研究所正在努力让 SHERLOCK 能够在发展中国家使用。在疫情爆发期间，这样相对快速、廉价、可靠、即时的技术是十分需要的。无论是现实还是影视作品，我们或许可以告别“送回实验室验一验”这种场面了。

参考资料：

[1] http://science.sciencemag.org/content/360/6387/444

[2] O. Faye et al., J. Clin. Virol. 43, 96–101 (2008).

[3] I. Bosch et al., Sci. Transl. Med. 9, eaan1589 (2017).

[4] Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017 DOI:10.1126/science.aam9321

[5] http://science.sciencemag.org/content/360/6387/439

[6] L. Yuan et al., Science 358, 933–936 (2017).

[7]https://www.broadinstitute.org/news/crispr-based-diagnostic-sherlock-optimized-rapid-use-during-viral-outbreaks-and-pandemics

文章来源：生物360