《Nature》：免疫学单细胞研究新技术

对单个白细胞的研究可以帮助科研人员了解这些免疫细胞在对抗疾病的过程中都发挥了哪些具体的作用。

不断发展的蛋白质组学技术和测序技术正在帮助科研人员更深入地认识免疫细胞。

人体的免疫系统是一个非常庞大，而且非常分散、各自为政（decentralized）的守卫大军。尽管有数十亿分工明确的免疫细胞不停地守护着人体的安全，但是我们很难明确指出，在某个时刻、某个地方，哪个免疫细胞在执行什么任务。随着蛋白质组学技术和基因组学技术的发展，科研人员也在不断加深他们对人体免疫系统的认识和了解。研究人体免疫系统是一个非常庞大的工程，这项工作产生的数据量将会是人类基因组计划（Human Genome Project）数据量的 1000 亿倍。

数十年来，免疫学家主要依靠流式细胞技术（flow cytometry）开展免疫学研究，并通过不同的荧光标签对细胞进行标记和研究。近 8、9 年来，该领域又兴起了质谱流式细胞技术（mass cytometry，又名 CyTOF）。该技术主要利用金属离子对细胞进行标记，它为科研人员提供了更多与肿瘤、结核和疟疾等病理状态下的免疫反应有关的信息。

可是，这些技术也只能一窥皮毛，无法真正了解 T 细胞和 B 细胞的详细工作情况。据美国纽约斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center in New York City）的分子生物学家 Jennifer Sims 介绍，由于这些细胞都会表达独特的蛋白质分子，比如 T 细胞受体和 B 细胞受体，所以也能精确地识别特异性的靶标，并做出相应的反应，而且这一系列生理过程还都在不断的进化之中。免疫细胞可以说是人体内最“有个性”的细胞了。

这些细胞表面受体能够识别各种病原体和肿瘤细胞表达的各种特异性的分子和抗原。一旦受体侦测到有害的抗原，它们就会激活免疫细胞，使其增殖，并且转移到有害物质所在位置，发动免疫攻击。每一个受体都是由免疫细胞内大量的基因重排之后编码而成的，都是独一无二的。上个月，美国芝加哥市召开了美国癌症研究学会（American Association for Cancer Research），其中有一个分会场就是专门讨论 T 细胞分析技术的。在我们一生中，这些与疾病斗争的免疫细胞可以表达出 1020 个不同的受体，Sims 就是这个专场的主席。

科研人员希望通过对这些受体（包括 B 细胞受体）的研究能揭开人体免疫系统进化，以及对抗疾病之谜。可是流式细胞技术只能获得非常粗浅的信息，比如哪些细胞增多了，哪些细胞变少了，而免疫受体分析技术（immune-receptor profiling method）则可以明确指出哪一些细胞克隆参与了免疫反应。据美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）的化学物理学家 Alex Shalek 介绍，科研人员为了研究这些特化的受体，以及进一步提高单细胞分析技术，又开发出了一大批以测序为基础的研究手段。Shalek 自己的实验室也开发了一系列的工具，来研究这些免疫细胞在正常和病理状态下，彼此之间是如何相互作用的。Shalek 设想，正如 DNA 仅仅依靠 ATGC 这四个“字母”就可以编码出大量的基因，从理论上来说，如果利用特异性的 DNA 小片段对抗体进行标记，也可以标记无数抗体蛋白。

而且，这些试验技术还可以极大地丰富免疫学的研究手段，比如科研人员就可以借此开展转录组学研究工作等。虽然目前这些技术还不如流式细胞技术那么完善和成熟，但是这些以测序技术为基础的研究手段可以在任何一个有测序仪的实验室开展，也可以在医院、诊所里使用。未来随着测序仪的小型化和便携化，还可以在更多的地方得到应用。科研人员现在至少有 6 种商业化的系统可以选择，也可以设计最适合自己需要的试验方法，来研究单个免疫细胞里的 RNA 和蛋白质，将隐藏在这些 RNA 和蛋白质里的秘密破译成 DNA 测序仪可以轻而易举解读的“明码文件”。

Sims 认为，综上所述，这些新技术都可以帮助科研人员用更精细的手段去认识不同免疫细胞在不同病理微环境下的活动和作用。

从荧光标记到金属标记

流式细胞技术是一种光学研究手段，它可以将细胞按照不同的特性进行分类，比如根据细胞的大小、是否含有颗粒（granularity）、是否表达某些特殊的分子（可以用荧光标记的抗体标记这些分子）等。流式细胞技术之所以叫“流式”细胞技术，就是因为细胞会“流过”一个个激光发射器和检测器，接受这些设备的检验和分析。

数十年来，流式细胞技术一直都是免疫学研究的最主要手段，但它也有自身的劣势和局限性。比如，可见光谱的波长范围就是一种限制，使得我们可以选择的标记物只有十几种而已，这么少的标记物完全不能研究细胞群体，或者复杂的细胞表型。

2009 年，加拿大多伦多大学（University of Toronto in Canada）的化学家 Scott Tanner 想到了一个好主意，那就是 CyTOF。这是一种将流式细胞技术和质谱技术相结合的新技术，使用金属来标记抗体，这一下子就将标记物的数量提升到了 50 多种。

美国斯坦福大学（Stanford University）的遗传学家 Garry Nolan 等人使用 CyTOF 一次检测了人骨髓细胞的 34 种不同的参数，同时跟踪检测了不同免疫细胞对不同药物的反应。自此，CyTOF 一下子就流行开来了。美国斯坦福大学的生物化学家 Sean Bendall 当时也参与了 Nolan 的工作，据他介绍，这种新技术让他们一下子进入了真正复杂的单细胞（及少量细胞群）研究世界，他们不用再关注免疫反应是在哪里发生的这个问题了。DVS Sciences 公司是世界上第一个推出商业化 CyTOF 的公司，该公司于 2014 年被美国南加州的 Fluidigm 公司收购。

做流式细胞试验的科研人员通常都会选择少数几种标记物来对每一种免疫细胞进行标记，比如使用 CD19 来标记 B 细胞，CD4 或 CD8 来标记 T 细胞等。不过，这种方法只能解决大致的问题，因为这几种荧光染料的激发光谱和发射光谱都有重叠，所以得到的荧光图像都不太清晰。可是以色列理工学院（Technion Israel Institute of Technology in Haifa）的神经免疫学家 Asya Rolls 想从全局上了解小鼠大脑里的免疫细胞都在干什么，于是她决定使用 CyTOF。

她同时选择了 44 种不同的抗体，结果有了一个重大的发现——有一部分 T 细胞表面表达了大量的 CD86 分子。在体内的其它地方，T 细胞通常都不会表达 CD86 分子，这种分子只会在其它免疫细胞表面表达，起到调节 T 细胞活化的作用，在脑内的 T 细胞上发现 CD86 分子是非常奇怪的。因此，Rolls 认为 CyTOF 是一种非常好的研究手段。

在使用 CyTOF 发现了哪一些细胞、哪一些分子值得关注之后，再使用流式细胞技术就比较合适了。因为流式细胞技术的检测速度非常快，每秒可以对 1 万多个细胞进行检测，而 CyTOF 的速度只有每秒 1 千个细胞。而且 CyTOF 每一个样品都会使用很多种不同的抗体，因此，失败的代价也很大。而且经 CyTOF 检测过的细胞也不能再使用了，因为和质谱检测一样，这些样品需要经过气化才能进行检测。

但是 CyTOF 可以对每一个细胞、每一个化合物进行多参数检测，这就可以开展表观遗传学组（epigenome）研究。美国斯坦福大学的一个课题组就开展了这样的研究。他们在上个月报道，年长者体内免疫细胞的表观遗传学异质性（epigenetic heterogeneity）更高。这一现象也印证了我们长期以来的一个假设，即人体的免疫系统会随着年龄的增长而衰老，细胞之间在基因表达方面的差异会越来越大。

成熟 B 细胞等适应性免疫细胞可以表达多种不同的抗原受体。

DNA 标记技术

差不多十年前，开始出现了一大批使用 CyTOF 的论文，这也引起了美国加州大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的物理学家、微流体设备（microfluidics device）的开发者 Adam Abate 的兴趣。据 Abate 介绍，他当时也在看 Garry Nolan 的论文，两者也在定期座谈、交流。这些研究也让 Abate 意识到同时研究单个细胞的多个参数的重要性。CyTOF 的出现也催生出了一大批蛋白质标记物的出现，从过去的十几个一下子增长到了 100 个左右。但是 Abate 认为还可以更多一点标记物。人体细胞内大约有 2 万多个蛋白质编码基因，还有 1 万多个变异体。所以我们肯定还需要更多的标记物。

于是 Abate 开始尝试使用另外一种完全不同的标记方法，那就是 DNA 小片段标记方法。仅仅依靠 ATGC 这四个碱基就可以编码出无数个独特的条形码序列（barcode），用来标记各种细胞和分子。Abate 利用这些经过了 DNA 序列标记的抗体对细胞进行染色，然后将细胞送入仪器，裂解细胞，并且将抗体上的标记序列裂解成二级序列（second barcode），然后根据这些序列判断出相应的细胞，最后用 DNA 测序仪对这些序列进行分析。为了能够对单细胞进行分析，Abate 也用上了微流体设备。他们开发出了 Abseq 技术，将一个个经过抗体染色的细胞注入只有 10 微米大小的液滴中，这些液滴里含有特定的 DNA 条形码，可以对细胞和抗体进行标记。尽管与流式细胞技术相比，Abseq 技术的处理速度更慢，但是从理论上来说，Abseq 技术可以对单个细胞里的无数个蛋白质进行检测和分析。这样一来，我们就可以了解在不同的病理状态下，都有哪些免疫反应在发生。这对于肿瘤这种高度异质性的疾病尤为重要，因为每一种肿瘤激活或抑制的免疫细胞都有可能不一样。

Abate 实验室的博士后 Sam Kim 参与了 Abseq 技术的开发过程，他认为，只有和其它单细胞技术结合起来，才能发挥出 Abseq 技术的真正实力。因为 Abseq 技术的输出结果都是测序仪可以直接读取的，所以完全可以和其它单细胞突变信息、蛋白质组学、转录组学等各个组学数据结合起来，以发挥出更大的作用。

美国南三藩市（South San Francisco）的 Mission Bio 生物科技公司已经注册了 Abseq 技术，准备开发这种多组学研究系统。去年 10 月在美国佛罗里达州召开了美国人类遗传学学会（American Society of Human Genetics）年会，Mission Bio 生物科技公司在此次大会上首次推出了他们的基因突变分析系统，他们现在也已经开发出了蛋白质和 RNA 分析系统。美国加利福尼亚州的 BD 生物科技公司也在开发类似的技术。去年 9 月，BD 生物科技公司也推出了他们的定制化单细胞分析产品——Rhapsody 系统。据该公司负责 Rhapsody 系统的产品经理 Nikhil Rao 介绍，他们这套系统不是做全转录组分析的，而是根据客户的要求，重点研究几百个转录体，这就将数据量缩减了一个数量级，也节省了大量的成本。BD 生物科技公司计划在今年晚些时候，将他们自己的 AbSeq 产品也纳入 Rhapsody 系统之中，使其同时具备蛋白质分析能力。

DIY 你的专属研究平台

据 Shalek 介绍，单细胞转录组学分析技术还可以用于对整个免疫系统进行研究。这些新技术也给我们提供了一个前所未有的新窗口，从全基因组的角度来观察细胞在某个时刻的基因表达情况。

现在，研究人员既可以购买商业化的设备，也可以自己 DIY 研究平台。2015 年，美国哈佛医学院的两个课题组就分别开发出了 inDrop 平台和 Drop-seq 平台。这两个平台都使用了微流体设备，在全基因组层面对细胞的 RNA 表达情况进行了分析，可以一次对数千个细胞进行检测。今年 2 月发表的一篇论文介绍了如何利用 3D 打印技术打造出一个紧凑版的 Drop-seq 平台。

在商业化方面，美国加利福尼亚州的 10X 基因组学公司则推出了一款高端设备，他们可以在一天内，将细胞样品转换成测序数据。英国的 Blacktrace Holdings 公司则推出了两款设备，一种是整体式设备，提供了全套服务；另外一种则是模块化设备，可以根据自己的需要进行个性化的组装。

不过这些液滴式的技术也有其弊端。比如无法应用于只含有少量细胞的临床样品、如果在每个液滴里只含有一个细胞，就会浪费大量的试剂等。

Shalek 和美国麻省理工学院的化学工程师 Christopher Love 为了解决这些问题，开发出了 Seq-Well 这种单细胞 RNA 测序系统。Seq-Well 系统可以让细胞悬浮在一个含有 8.6 万个大小不到毫微升（subnanolitre）的小孔的硅芯片上。Shalek 指出，你可以把这个硅芯片想象成家里制作冰块的冰盒。BD 公司也使用了类似技术，通过这些小孔来固定这些细胞。

Shalek 认为，Seq-Well 系统最突出的一个优势是便携性。他们实验室的工作人员就带着这套系统去过泰国，帮助那里的同事分析间日疟原虫（Plasmodium vivax）感染者的细胞。他们也为南非德班的非洲健康研究所（Africa Health Research Institute in Durban, South Africa）的科研团队进行过 Seq-Well 系统的培训，让那里的科研人员使用 Seq-Well 系统对采自非洲 HIV 病毒感染者的淋巴结样品进行免疫细胞分析。

关于采集多组学数据的研究策略，也在不断发展中。比如去年，就有两个课题组分别使用 REAP-seq 平台和 CITE-seq 平台同时对单细胞进行了蛋白质和 mRNA 分析。美国纽约大学 Langone 医学中心（New York University Langone Medical Center）和德国波恩的多机构合作组织——西德基因组中心（West German Genome Center）也正在联合开发类似的技术。Langone 医学中心方面的负责人 Pratip Chattopadhyay 表示，客户可以将他们的试验样品寄给他们，由他们来做单细胞分析。西德基因组中心则主要负责组织专家组提供技术咨询。

德国波恩的德国神经变性疾病中心（German Center for Neurodegenerative Diseases in Bonn）的肿瘤免疫学家 Joachim Schultze 表示，这是一个发展得非常快的领域，涌现出了大量的新技术、新方法。没人能够预测在十年之内，这个研究领域会发展到什么地步。

更多阅读：聚焦免疫受体（immune receptors）

弄清在人体内的数万亿个 T 细胞和 B 细胞受体中，哪些受体参与了对抗疾病的免疫反应，这看起来似乎是一个不可能完成的任务。但是一些特殊的测序方法可以给我们提供一些机会。目前，大约有 5 / 6 家公司正在提供相关的科研服务，或者提供相关的试验材料，来研究 T 细胞受体和 B 细胞受体的基因重排问题。通过厘清这些重排基因序列，并了解它们的交换机制，科研人员就可以确定哪些细胞克隆在病理过程中发挥了免疫作用。美国西雅图市的 Adaptive 生物科技公司提供了一套解决方案。科研人员可以将自己的冰冻组织，或者提取好的 DNA、RNA 样品交给 Adaptive 生物科技公司，由该公司完成整个实验工作，最后返回试验数据（比如具体的核酸序列，以及这些序列出现的频率等）。还有一些公司也提供 DIY 服务，比如美国科罗拉多州的 ArcherDx 公司、美国加利福尼亚州的 Takara Bio 公司、美国阿拉巴马州的 iRepertoire 公司、美国马萨诸塞州的 New England Biolabs 公司等都在销售多重 PCR 引物。科研人员可以利用这些引物扩增出 T 细胞受体和 B 细胞受体的基因片段。每一个系统都有各自的优势和劣势。有些更适合分析冰冻组织样品、有些则更适合分析用福尔马林固定、石蜡包埋的样品，而有些则更适合分析肿瘤细胞的 DNA。不过所有的技术都面临一个共同的问题，那就是很难鉴别究竟是真实的生物学改变（比如在免疫反应过程中出现的某种细胞群体的微小扩张），还是因为使用了各种酶导致的试验误差。

原文：Single-cell approaches to immune profiling

DOI号：10.1038/d41586-018-05214-w