聚焦液体活检技术发展

作为传统活检的替代技术以及癌症早期筛查的新技术，液体活检技术通过非侵入性的血液取样方式获得肿瘤信息以辅助癌症治疗，是“精准医疗”领域中具代表性的诊断技术。

目前液体活检主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、外泌体和循环RNA。这些物质均可以通过肿瘤周边的血管进入血液循环，通过抽取血液样本检测这些物质，可以用于肿瘤的早期诊断、疗法选择、预后判断和疗效监测等。

图：液体活检的内容和作用

一、循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells， CTCs)

1869年，澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念。 目前， CTCs是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。

CTCs转移过程中必经阶段：

CTCs通过从肿瘤组织中脱落游走至血管，穿过血管进入血循环，克服自身及血循环中各种因素的杀伤作用，到最后定植形成新的转移灶等多个生理步骤，使得CTCs可顺利侵袭转移从而促进相关疾病的进展。

图：CTCs转移过程

CTCs的检测：

对CTCs检测包含细胞富集和细胞检测两部分，可以进行不同的组合，形成不同的技术。最常见的富集方法是抗体介导或物理方法富集，接下来进行免疫组织化学计数或遗传分析。

图：CTCs细胞富集和细胞检测过程（A行显示了磁珠-抗体富集方法；B行显示了物理富集方法；C行显示了最常用的细胞检测方法。）

通过对血液中CTC的数量以及蛋白表达、序列检测等可以获取肿瘤的病变信息。

目前已发展出一代CTC技术用于对CTC数量检测。

Immunicon公司的Cellsearch  CTC 检测系统2004年通过FDA认证，也是唯一通过FDA批准用于临床的一代CTC检测系统，可以说是行业内的金标准。2012年Cellserach系统通过CFDA认证进入中国市场。目前Immunicon公司被强生子公司Veridex所收购。尽管一代CTC技术领先进入临床应用，但目前技术水平尚不完善，只能用于对CTC数量的检测，无法进行进一步的深入检测，加上灵敏度较低，应用局限于转移性乳腺癌、转移性结直肠癌和转移性前列腺癌。

二代CTC技术正在加速研发实现中，相比于一代，二代CTC将能够实现对CTC细胞除数量以外的基因测序、蛋白表达、染色体变异水平等更全面的检测，获取更多肿瘤信息，同时灵敏度也将进一步提高，做到肿瘤的提前发现和治疗。二代CTC研发的参与公司众多，但目前还没有被批准上市的产品，没有形成行业内标准，更没有行业巨头出现，处于较多参与者竞争局面，技术不断成熟当中。

二、血浆游离肿瘤DNA('Cell-Free' Circulating Tumor DNA，ctDNA)

ctDNA（circulating tumor DNA）即循环肿瘤DNA ，是人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因的DNA片段。一般来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外泌体。通过对ctDNA片段捕获测序可以获得肿瘤特异性突变信息，帮助医生诊断和个性化用药指导。

图：ctDNA来源

ctDNA的检测：

ctDNA的检测平台目前有二代基因测序和数字化PCR，可分别对ctDNA的序列信息和序列数量做检测，适用于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌等常见肿瘤，检测的目标基因目前多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等热门基因为主。ctDNA的片段捕获需要提前知道和准备待检测突变，突变文库的制备过程繁琐且高成本。ctDNA尚没有FDA认证产品问世，目前还处在科研阶段。与CTC相比，二者均属于液体活检范畴，高灵敏度和低成本，适用于大多数肿瘤检测，并且可同时从血液中提取，获得互补信息。

三、外泌体(exosome)

外泌体（exosome）是细胞分泌出的包含了复杂 RNA 和蛋白质的30-150nm的小囊泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

1983年发现于绵羊网织红细胞中的外泌体，近年来成了研究领域里的明星，大量的相关研究见诸报道。尤其2015年以来外泌体研究与应用飞速发展，国自然基金外泌体中标项目和文章发表数量大幅增加。

图：外泌体国家自然科学基金中标项目

外泌体与肿瘤发展

外泌体是肿瘤诊断、肿瘤发展和肿瘤治疗的重要参与者。

外泌体的主要功能就是递送各种生物分子，包括蛋白质、多肽配体、DNA和RNAs。因此肿瘤细胞分泌的外泌体在肿瘤发展和治疗中扮演角色主要表现在以下方面：1、促进肿瘤细胞发展，侵袭和转移；2、促进肿瘤的血管新生；3、肿瘤免疫调节；4、肿瘤化疗的增敏作用。

图：外泌体在肿瘤发展中的角色

外泌体的分析

外泌体数据库 ExoCarta，目前已包含9769种蛋白质，4946种mRNA条目，3408种mRNA，2838种miRNA，1116种脂质条目。

通过超速离心法或者磁珠法提取外泌体后，分离纯化出来的exosome可以做蛋白，也可以做RNA（microRNA和LncRNA），36%的研究人员通过Westernblot或其他方法来鉴定蛋白，29%的人员利用qPCR对microRNA表达谱进行分析，9%利用芯片进行microRNA表达谱分析。 同时，新一代测序的用户也不少，13%的人员利用NGS开展microRNA/小RNA研究，9% 开展mRNA研究，另外基于组学研究的质谱分析法也越来越常用。此外，目前的大部分工作还是停留在科研阶段，后续的生物标志物开发和验证不多，而诊断和疗法的开发就更少。Razvi认为，exosome的定性和定量研究是个快速发展的市场。同时，循环生物标志物的市场也存在着机遇和挑战。不过，无创产前检测技术的成功让人们相信，循环生物标志物有望在肿瘤及其他疾病的诊断上发挥作用。

液体活检技术使得癌症早期阶段的筛查成为可能，无论是肿瘤诊断，治疗还是监控领域，液体活检的优势都使其成为最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段，具有极高的临床应用价值和市场前景。

整个液体活检领域大致可以分为上游样品捕获技术，中游测序服务和下游数据分析。上游技术和下游的数据分析是技术壁垒较高的环节，目前的研发公司也都聚焦在上游的技术开发，数据积累是后续的环节。基因测序则是比较成熟的环节，国内提供测序服务的公司像华大基因、达安诊断等均已占据一定的市场，测序技术也在不断更新换代中。

图：中国液体活检企业产业布局汇总（数据来源：动脉网）

根据动脉网2017年中旬对国内液体活检相关企业产业布局的摸底，液体活检可分为6个子领域，即上游的捕获、基因扩增、试剂以及仪器市场；中游检测服务市场以及下游数据市场。

由于上游市场的技术难度较大，更多的企业选择在中游环节布局。目前，涉足上游捕获市场的企业有13家，基因扩增相关企业6家，中游环节布局企业则有37家。

表：液体活检相关企业扫描（数据来源：动脉网）