郑州大学开发新型基因编辑工具 提高基因编辑效率3至4倍

2018年7月10日，郑州大学宋永平课题组等人在Cell Discovery上在线发表了题为“Genetic editing and interrogation with Cpf1 and caged truncated pre-tRNA-like crRNA in mammalian cells”的研究论文。研究人员报道了一种Rnase抗性的pre-tRNA-like crRNA (catRNA)，它可以利用Lachnospiraceae细菌Cpf1（LbCpf1）进行精确有效的基因编辑。 与常规crRNA诱导的相比，catRNA的特异性基因敲除和敲入分别增加了3.2倍和4.3倍。该研究揭示了catRNA的潜力和CRISPR / Cpf1系统的通用应用，为哺乳动物细胞中的选择性基因扰动建立了一种简单的方法。

Cpf1是一种新型的II类CRISPR系统组件，具有与Cas9不同的特征，是一种单一RNA引导的核酸内切酶，可识别富含胸苷的原型间隔区相邻基序（PAM）并在PAM位点远端产生交错切。 这种V型CRISPR / Cpf1系统在哺乳动物细胞、以及动物，植物和细菌中表现出强大的基因组编辑活性。 有趣的是，Cpf1是一种双核酸酶，不仅可以切割靶DNA，还可以处理自身的CRISPR RNA（crRNA）。 此外，Cpf1对crRNA的成熟不需要反式激活crRNA（tracrRNA）的帮助。 由于具有这些优点，Cpf1系统最近被用于哺乳动物和植物细胞中的多重基因编辑，其中Cpf1使用由成熟直接重复12,13间隔的单个crRNA阵列同时编辑多达四个基因。

设计Rnase抗性的pre-tRNA-like crRNA (catRNA)

与Cas9的高脱靶潜力相比，全基因组深度测序揭示了Cpf1非常精确的基因破坏，使得Cpf1成为Cas9的理想基因修饰替代物。尽管Cpf1在哺乳动物细胞中介导有效的基因编辑，但其整体活性不如Cas9那样强大。研究人员推测crRNA部分地降低了其降低的基因破坏效率，因为crRNA中存在的茎环结构较少，比sgRNA中的各种茎环提供的RNA酶抗性更少。tRNA是最稳定的RNA分子，因为它们具有多个发夹（或茎环）和3'ploy尾结构，其赋予对各种RNase分子的抗性。pre-tRNA偶尔在其5'末端用甲基鸟苷封端。最近在酿酒酵母中进行的一项研究发现，甲基鸟嘌呤帽结构可保护前tRNA免受RNase的降解，并且帽结构可能在成熟过程中起到保护pre-tRNA的屏障的作用。

catRNA增强哺乳动物细胞的敲除和敲入

在此，研究人员报道了一种Rnase抗性的pre-tRNA-like crRNA (catRNA)，它可以利用Lachnospiraceae细菌Cpf1（LbCpf1）进行精确有效的基因编辑，并能够将缺乏DNA核酸内切酶活性的LbCpf1（dCpf1）重编程为转录调节因子。 与常规crRNA诱导的相比，catRNA的特异性基因敲除和敲入分别增加了3.2倍和4.3倍。 当使用电穿孔时，观察到更高的基因破坏增加（高达37倍）。 研究人员在此报道catRNA能够通过dCpf1激活剂进行有效的基因激活。该研究揭示了catRNA的潜力和CRISPR / Cpf1系统的通用应用，为哺乳动物细胞中的选择性基因扰动建立了一种简单的方法。

原文链接:Genetic editing and interrogation with Cpf1 and caged truncated pre-tRNA-like crRNA in mammalian cells