《Nature》：CRISPR编辑技术面临新的安全隐患（专家解读）

CRISPR–Cas9技术将来在临床上的应用面临最大的顾虑是Cas9的脱靶率。

5月30日，Nature Methods发表的一篇文章声称“CRISPR-Cas9技术可引发基因组上发生数百个意想不到的的基因突变”（CRISPR可致数百个位点突变，引入基因治疗需谨慎），引起轩然大波，不过该论文在今年3月份被撤稿（争议热门论文遭撤稿丨特别关注）。

然后今年5月份，Genentech公司的研究团队在Nature Methods杂志上发表文章，详细分析了编辑的小鼠和大鼠身上的脱靶位点（重审CRISPR的脱靶效应，Nature Methods发文全面分析基因编辑鼠的脱靶位点）。

事实上，CRISPR–Cas9技术除了面临脱靶问题，另一个面临的深层次问题是还可能在作用靶点附近导致大规模的DNA删除，在部分情况下，甚至引起复杂的DNA重排，研究人员发现在小鼠干细胞和人类视网膜色素上皮细胞内，可能出现规模达数千DNA碱基的删除，导致临近基因或调控序列可能受到影响，并改变细胞功能，因此引起的DNA重排问题也成为了CRISPR–Cas9技术面临的另一个安全隐患，相关工作刚刚在线发表在Nature Biotechnology杂志上。为了使读者更好的了解该工作，BioArt特别邀请了对相关领域有过深入研究的北京大学胡家志研究员对该工作进行点评分析，以飨读者！

论文原文：Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

点评丨胡家志（北京大学）

CRISPR/Cas9在基因治疗方面展现出巨大的潜力，其主要通过在预定位点上产生DNA双链断裂来启动基因的改造或替换。作为高表达量的外源性酶，Cas9在哺乳动物细胞内并无共演化形成的严密调控系统，几乎注定它会成为一匹脱缰野马，在基因组上造成预计外的损伤。不久前Warming团队及合作者在Nature Methods上撰文，在单细胞水平上对Cas9的脱靶活性进行了描述【1】（重审CRISPR的脱靶效应，Nature Methods发文全面分析基因编辑鼠的脱靶位点）。

Bradley及其同事刚刚在线发表的这篇Nature Biotechnology文章进一步探讨了CRISPR/Cas9在目的编辑位点附近所造成的大片段缺失及其它复杂的重组【2】。他们所呈现的最新结果并不让人意外，这些数据表明CRISPR/Cas9造成的DNA双链断裂与其它机制产生的DNA双链断裂并无明显不同，尽管有报道表明Cas9在切开DNA后会在断裂末端上停留【3】，可能会影响下一步的修复过程。

DNA双链断裂的修复需经历四个步骤──识别、加工（如必要）、连接及末端拴绑。DNA双链断裂发生后，以ATM激酶为首的DNA修复通路会识别损伤并启动修复【4】。

首先，一部分DNA双链断裂会被末端直连修复（非精准修复），其中一些会造成损伤位点附近的突变；在基因编辑领域，我们称之为序列增删 (indels)，这也是经常被用来衡量CRISPR/Cas9切割效率的标志。其次，会有一部分断裂的末端未能直连修复，则会被一些酶加工/切除，如果这部份被加工的末端随后被末端连接修复，则会造成片段缺失；这一可控步骤在DNA修复领域被称为强切除 (Extensive resection)，集中在断裂的±3 kb左右【5】，所以Bradley及其同事在Cas9切割位点附近5500 bp的区域内发现了大量的片段缺失 。这部份加工后的末端也可能被精准修复，即同源末端重组，修复后的产物在Bradley及其同事的检测方法中不可见。再次，有很少一部分DNA末端的加工能延长至100 kb甚至更远的范围，被称为长程切除 (Long resection)，其被末端连接修复会造成大片段缺失【5-7】，其中部分跟也被Bradley及其同事发现。最后，DNA断裂的两个末端可能失去拴绑的纽带，各自与基因组上的其它损伤末端连接形成染色体易位等更复杂结构【5,8】，这部份被Bradly及其同事预测到。

关于CRISPR/Cas9造成的各种染色体异常结构，笔者及同事在2015年发表在Nature Biotechnology的论文中利用开发的高通量CRISPR/Cas9脱靶活性检测方法 (LAM-HTGTS) 也鉴定过并有系统的描述，包括片段缺失、插入、倒置、染色体易位、双着丝粒染色体等【5】。Bradley他们及我们的工作表明，对CRISPR/Cas9脱靶活性的关注，不仅仅要关注具有相似序列的脱靶位点上，还应涉及到其它各种染色体异常结构。

目前看来，CRISPR/Cas9造成的基因组DNA双链断裂可能给细胞群带来一些染色体异常结构，因此其并不能直接运用于人体。但笔者觉得眼前至少有两种方案可能有助于规避这种异常：一是从CRISPR/Cas9处理过的细胞群中通过筛选的方法筛到不含有异常结构的细胞并进行扩大培养，但须防止筛选到p53抑癌基因缺失的细胞【9,10】；二是单碱基修饰酶 (Base editor)，其作用不依赖于DNA双链断裂，但其脱靶活性仍待进一步鉴定。

参考文献：

1. K. R. Anderson et al., CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.Nat Methods,  (2018).

2. Michael Kosicki et al., Repair of CRISPR–Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol,  (2018).

3. S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna, DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507, 62-67 (2014).

4. Frock RL, Hu J, Alt FW. Mechanisms of recurrent chromosomal translocations. In book: Chromosomal translocations and genome rearrangements in Cancer. Springer International Publishing, ISBN: 978-3-319-19983-2.

5. R. L. Frock et al., Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nat Biotechnol 33, 179-186 (2015).

6. R. Chiarle et al., Genome-wide translocation sequencing reveals mechanisms of chromosome breaks and rearrangements in B cells. Cell 147, 107-119 (2011).

7. I. A. Klein et al., Translocation-capture sequencing reveals the extent and nature of chromosomal rearrangements in B lymphocytes. Cell 147, 95-106 (2011).

8. J. Hu et al., Detecting DNA double-stranded breaks in mammalian genomes by linear amplification-mediated high-throughput genome-wide translocation sequencing. Nat Protoc11, 853-871 (2016).

9. E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale, CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, (2018).

10. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells.Nat Med 24, 939-946 (2018).