基因编辑超级大牛Church连发2文章 开发新型编辑方法

CRISPR已经应用于包含人类，小鼠，酵母，水稻等各个物种中，取得了空前的成功。2018年7月16日，哈佛大学医学院Church研究组在Nature Method在线发表题为“An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation”的研究论文，研究人员组装并筛选了强效阻遏物结构域的组合，以设计出高效的dCas9-KRAB-MeCP2转录抑制因子，这极大增强了Cas9的抑制表达的效率。另外，2018年5月21日，哈佛医学院Church研究组在Nature Biotechnology在线发表题为“High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast”的研究论文，该论文介绍了一种基于Cas9的方法，用于在酵母中产生具有80-100％效率的定义的遗传改变（缺失，取代和插入）的突变体库，以及追踪它们的整体的方法。该方法可以进一步应用于定向进化，代谢工程和非编码元件的功能性检测。这对于临床应用，具有非常大的前景。

01.用于靶向哺乳动物基因调控的增强的CRISPR阻遏物系统

CRISPR-Cas9系统，是介导细菌和古细菌的适应性免疫，已成为基因工程的强大工具。 Cas9是RNA引导的核酸内切酶，可以通过Cas9相关的指导RNA（gRNA）和靶基因座之间的互补性导向特定的DNA序列，条件是PAM相邻的基序容易被靠近。然而，由于DNA双链断裂的形成，Cas9切割可导致细胞毒性，并且Cas9产生的修饰是不可逆的，这两者都限制了其更广泛的应用。

在Cas9中，可以突变对DNA催化至关重要的氨基酸以产生核酸酶失活的Cas9（dCas9），其仍然能够结合DNA但缺乏内切核酸酶活性。当针对基因的转录起始位点（TSS）时，dCas9可以物理阻断RNA聚合酶通过，从而导致基因沉默。通过向dCas9添加诸如Krüppel相关盒（KRAB）的抑制结构域，可以实现转录抑制的进一步改善，得到的dCas9-KRAB融合蛋白是基于dCas9的抑制研究的当前金标准。虽然它已被广泛采用，但与基于Cas9核酸酶的方法相比，dCas9-KRAB系统的敲低效率低，性能差。

以前的研究表明，几种转录调节因子与dCas9串联融合可以导致活性的协同增加，并且最初的努力集中于构建更有效的转录激活因子。在这里，美国哈佛医学院Church等研究组组装并筛选了强效阻遏物结构域的组合，以设计出高效的dCas9-KRAB-MeCP2转录抑制因子。

对于大多数测试的基因座，dCas9-KRAB-MeCP2比dCas9-KRAB获得更高程度的基因抑制。 基因沉默变异的潜在原因包括功能不良的指导，基因表达的靶向和测量之间的时间不足，局部染色质效应，Cas9与内源转录调节因子之间的结合竞争，以及已经存在的表观遗传标记的干扰，这阻碍了工具进一步修饰。 在大多数情况下，研究人员可以通过简单地使用一系列不同的sgRNA靶向相同的基因来克服这些低效率。

原文链接：An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation

02.使用CRISPR-Cas9在酵母中高通量创建和功能分析DNA序列变体文库

大型遗传变异文库的构建和表征对于理解基因组功能至关重要，但仍然具有挑战性。在这里，哈佛医学院Church等研究组介绍了一种基于Cas9的方法，用于在酵母中产生具有80-100％效率的定义的遗传改变（缺失，取代和插入）的突变体库，以及追踪它们的整体的方法。

Church等研究组证明了该方法的实用性，通过表征DNA解旋酶SGS1，其具有跨越蛋白质长度的小缺失突变体和针对蛋白质中高度保守残基的一系列点突变。此外，还创建了一个全基因组文库，针对分布在整个酵母基因组中的315个性能不佳的小开放阅读框（smORFs，长度<100个氨基酸），并评估了哪些对于在各种环境条件下生长至关重要。Church等研究组的策略允许以高通量的方式精确地研究基础生物学问题。

尽管Church等研究组专注于将该技术用于在酵母中编码元件的高通量表征，但是设想了广泛的附加应用，例如定向进化，代谢工程和非编码元件的功能性检测。 此外，考虑到大多数临床相关突变是点突变，并且鉴于酵母和人之间的高度基因保守性，Church等研究组的文章提供了一种简单的方法来设计和测试数百种目前未表征的单核苷酸多态性的强大功能。这对于临床应用，具有非常大的前景。

原文链接：High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast