《自然》子刊：颠覆认知！科学家未来有望操纵细胞修复方式

“再一次一无所知，从头开始……这让我很开心。”——斯托帕德《阿卡狄亚》

从2013年张锋[1]和George Church[2]第一次使用CRISPR-Cas9编辑人体细胞算起，这项技术在人体细胞中的使用已经走过5个年头。

虽然CRISPR被科学家使用的很溜，并已经走到临床试验阶段；但我们对Cas9的切割原理和切割后细胞修复机制的了解还比较少，甚至可以说它们还是个黑盒子。

前不久，上海交通大学吴强教授课题组在Molecular Cell上发表了一篇文章，他们发现Cas9切割DNA双链可以产生突出末端，而不仅仅是平头末端，这颠覆了我们对Cas9切割的认知[3]。

近日，加州大学伯克利分校的Jacob Corn团队在Cas9切割后的修复机制上也取得了颠覆认知的重大突破。

总的来说，Corn团队这次解决了一个长期困扰科学家的问题：用CRISPR-Cas9切断细胞的DNA之后，细胞究竟是如何选择用哪种方式修补断裂的缺口的？

更重要的是，他们的这个发现甚至可以让科学家以后根据自己的需求，操纵细胞的修复方式，让细胞基因组DNA在被Cas9切断后，按照需求去修复缺口。正真实现精准切割，精准修补。

这对很多需要做基因修复的遗传疾病而言，无疑是个好消息。上周四，Corn团队的这一重要研究成果发表在《自然遗传学》上[4]。

CRISPR-Cas9只是上帝的手术刀，修复还是得靠细胞

一直以来，我们都形象地把CRISPR-Cas9叫做“上帝的手术刀”，而不把它叫做“上帝的针线包”，主要是因为Cas9只负责精准的切断DNA，修复的任务要交给细胞自身。

通常情况下，CRISPR-Cas9切断DNA形成的双链断裂后，细胞会很快启动紧急修复机制。其中最主要的两条是：非同源末端连接和同源重组。

其中非同源末端连接修复机制被科学家用的最多，效率也最高。它就是不管三七二十一，尽快把断裂的DNA连接起来，维持DNA的稳定。这种修复方式绝大部分情况下会在切割位点产生随机插入或缺失，直接导致基因功能丧失。

无论如何，对细胞而言，损失一个基因，比挂了肯定好多了。这种修复方式其实也是细胞的最常见修复方式。鉴于这种修复方式的特点，它被广泛用于基因功能的研究。

而同源重组修复机制，则是在有同源供体DNA序列的配合下，用一段正确的基因序列替换原本错误的基因序列[5]。也就是我们常说的：哪里坏了，换哪里。科学家和医生治疗基因变异导致的疾病，依赖的就是这种修复方式[6]。

目前，同源重组修复过程中使用的外源DNA模版有两种：一种是双链DNA，另一种是单链DNA模版修复（SSTR）。

不过，大量的研究表明，把双链DNA作为模版修复断裂的DNA在绝大多数细胞类型中是非常低效的[7]。相较而言呢，以单链DNA为修复模版的SSTR模式在人类细胞中倒是很高效[8]，所以使用的也比较多。

虽然SSTR效率高，但是Corn团队在不同的人类癌细胞系中做研究还是发现，SSTR的修复效率还是有很大的差异，从完全无效的0%，到非常高效的30%。这似乎暗示，SSTR是否能完成修复与细胞类型有一定的关联。

再仔细一想呢，不同细胞类型的基因表达水平实际上是相差很大的，是不是某些特殊的DNA修复通路的打开或关闭，影响了SSTR修复的效率呢？

如果我们能发现影响SSTR修复机制的相关基因，那么在以后的临床应用中，在编辑基因的同时，特异性的调节相关基因的表达水平。那转化效率就可以大幅提升，治疗效果也会稳步提升啊。

研究人员赶紧去查查相关资料。

很幸运，SSTR在人体中修复的机制还鲜为人知。如果能解决这个困扰着很多科学家的问题，那么Corn团队肯定很开心。

此处应该再次出现斯托帕德那句话：“再一次一无所知，从头开始……这让我很开心。”

聪明的实验设计

Corn团队的研究人员究竟有多开心我是没办法知道了。不过，当我看到他们解决问题的思路时，我何止是很开心，简直是很兴奋，以至于喝了5杯浓茶也没驱散的午间睡意，瞬间消散。

他们首先做了一个假设：既然是DNA断裂的修复出现了不稳定的问题，那问题应该就处在细胞内跟DNA修复有关的基因上；如果在调控那些修复基因表达的同时，同步开展CRISPR-Cas9的剪切，和切断后的SSTR修复，不就可以通过二者之间的相互作用找到影响SSTR的关键基因了吗！

于是，研究人员首先找到了2000多个跟DNA修复有关的基因。然后做了一个非常聪敏的设计。

他们创造性的使用了CRISPRi基因沉默技术[9]、CRISPR-Cas9基因编辑技术和荧光标记技术，创建了一个可视化的“沉默-编辑”平台。

首先，他们给所有的细胞加了个蓝色荧光基因，让这些细胞发蓝光。

所有的细胞都蓝莹莹的，真好看~

然后，给这些细胞分别装入用来沉默修复相关基因的CRISPRi基因沉默系统。每个细胞沉默掉一个修复相关基因，在一个有数百万个细胞的群体中，就产生了2000个基因分别被沉默掉的细胞库。

紧接着，研究人员就要对那个蓝色荧光蛋白基因下手了。

他们把靶向切割蓝色荧光蛋白基因的CRISPR-Cas9编辑系统，以及一个与蓝色荧光蛋白基因有同源臂的绿色荧光蛋白基因的单链DNA，一起转到上面的那个细胞库里。

接下里会发生什么，你们肯定能想到把，还需要我说吗~

忍不住了，我还是说下吧。

理想状况下（我们只说理想状况下），上面的细胞库颜色会发生如下变化。有些还是蓝色，意味着基因编辑失败；有一些细胞没有颜色了，大概率意味着意味着Cas9把蓝色荧光蛋白基因切断了，然后细胞按照非同源末端连接的方式又把它随便连上了，导致基因功能丧失了；剩下的细胞成功变绿了，这些细胞实现了SSTR修复。

研究人员用流式细胞仪按照颜色，给所有的细胞分分成三拨：有6.8%的细胞还保持这蓝色，有67.5%的细胞不显色了，22.8%的细胞变成了绿色。

加起来是97.1%，还有2.9%的细胞怎么了？这些细胞出现了理想状况之外的情况，我们就不管它们了。

未被重视的“交通信号灯”

有了上面的细胞。接下来的事情就好办了，用二代测序技术，分析分析这三个细胞群体中gRNA的水平变化，就可以知道哪些基因会影响SSTR的效率了。

这一分析不要紧，研究人员发现之前认为与SSTR修复有关的DNA修复基因，似乎与SSTR关系并不大。

让研究人员意外的是，那些处在范科尼贫血（Fanconi anemia；FA）的通路上的基因，与SSTR关系密切。

范科尼贫血是瑞士儿科医生Guido Fanconi在1927年首次报道的，它是一种罕见的常染色体隐性遗传性血液系统疾病[10]。1992年报道了4个可能与FA相关的基因，到现在已经鉴定出了20多个与FA的发病有关的基因变异。

一直以来，研究人员认为，FA通路上的基因编码的蛋白与识别和修复基因组中的链间交联（ICL）有关。并不认为它与CRISPR-Cas9导致的DNA双链断裂修复有关。

这个发现，被研究人员视为至宝。

为了进一步证实FADNA修复通路上的蛋白与SSTR修复模式效率之间的关系。研究人员用CRISPRi分别稳定地敲低了FA路径中的FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCL，HELQ，UBE2T，USP1和WDR48。发现SSTR修复模式效率显著下降。

如果在敲低的同时，用cDNA在细胞内稳定地表达那个敲低的蛋白，让它们的表达恢复到野生的水平。研究人员发现，SSTR修复模式效率提升8倍，回升到正常水平。

这些研究表明，FA通路中的许多基因对SSTR修复模式是必需的。

更有意思的是，研究人员还发现FA通路只影响SSTR，它不会促进非同源末端连接。总体来说，在DNA被切断之后，细胞修复DNA的首选方式是非同源末端连接，这也是为什么这种修复方式一直比例最高。

而FA通路更像个“交通信号灯”：在FA通路不活跃的时候，所有的车都朝一个方向（非同源末端连接）开；但如果FA通路很活跃，那么它就要指挥其中一部分车往另一个方向（SSTR）走。

原来是这样！

用论文第一作者Chris Richardson的话说，就是“FA通路是维持非同源末端连接和SSTR之间平衡的”。

后记

“治疗镰状细胞贫血，成功的机会与用正确的基因替代突变的基因效率密不可分，”Richardson这么评价自己的研究[11]，“如果你从患者那里获得了100万个细胞，30%-40%的替换率肯定比10%的好多了。”

现在看来，Richardson的愿望真的有可能实现了。

将来，科学家可以通过分析细胞基因的表达水平，提前预知一类细胞是否适合SSTR。如果这类细胞SSTR效率低，甚至可以考虑临时激活FA通路。

无论如何，科学家掌握了Cas9切割后的这层修复机制，未来给患者换个基因啥的，那简直是效率高多了。

参考资料：

[1]. Cong L, Ran F A, Cox D M, et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[2]. Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[3]. Shou J, Li J, Liu Y, et al. Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-Mediated Nucleotide Insertion[J]. Molecular cell, 2018.

[4]. Richardson C D, Kazane K R, Feng S J, et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway[J]. Nature Genetics, 2018: 1.

[5]. Sternberg S H, Doudna J A. Expanding the Biologist’s Toolkit with CRISPR-Cas9.[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4): 568-574.

[6]. Cox D B, Platt R J, Zhang F, et al. Therapeutic genome editing: prospects and challenges[J]. Nature Medicine, 2015, 21(2): 121-131.

[7]. Chen F, Pruettmiller S M, Huang Y, et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases[J]. Nature Methods, 2011, 8(9): 753-755.

[8]. Richardson C D, Ray G J, Dewitt M A, et al. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA[J]. Nature Biotechnology, 2016, 34(3): 339-344.

[9]. Gilbert L A, Larson M H, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.[J]. Cell, 2013, 154(2): 442-451.

[10]. Walden H, Deans A J. The Fanconi Anemia DNA Repair Pathway: Structural and Functional Insights into a Complex Disorder[J]. Annual review of biophysics, 2014, 43(1): 257-278.

[11]. http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/