《Nature》：争议！2文连发强烈质疑CRISPR没有脱靶效应问题

2017年8月2日，美国俄勒冈健康与科学大学Mitalipov等研究组在Nature发表题为“Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos”的研究论文，该论文通过激活内源性，种系特异性DNA修复反应，描述了人类植入前胚胎中杂合MYBPC3突变的校正，具有精确的基于CRISPR-Cas9的靶向准确性和高同源性定向修复效率。

使用同源野生型母体基因而不是合成DNA模板主要修复突变体父本等位基因处的诱导双链断裂（DSB）。通过调节诱导DSB的细胞周期阶段，能够避免切割胚胎中的镶嵌现象并实现携带野生型MYBPC3基因的纯合胚胎的高产量，而没有脱靶突变的证据。

考虑到该文提到的同源修复及脱靶问题，2018年8月9日，Nature连发两篇文章进行了强烈的质疑，同时作者进行了相应的回复。故以后要说没有脱靶等问题，一定得谨慎。

1.背景介绍：人胚胎致病基因突变的校正

基因组编辑具有靶向校正种系突变的潜力。在这里，美国俄勒冈健康与科学大学Mitalipov等研究组通过激活内源性，种系特异性DNA修复反应，描述了人类植入前胚胎中杂合MYBPC3突变的校正，具有精确的基于CRISPR-Cas9的靶向准确性和高同源性定向修复效率。

使用同源野生型母体基因而不是合成DNA模板主要修复突变体父本等位基因处的诱导双链断裂（DSB）。通过调节诱导DSB的细胞周期阶段，Mitalipov等研究组能够避免切割胚胎中的镶嵌现象并实现携带野生型MYBPC3基因的纯合胚胎的高产量，而没有脱靶突变的证据。所提出方法的效率，准确性和安全性表明，通过补充胚胎植入前遗传学诊断，它有可能用于纠正人类胚胎中的可遗传突变。然而，在临床应用之前还有许多事项需要考虑，包括该技术与其他杂合突变的再现性。

原文链接：Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos

2.质疑1：由Cas9裂解诱导的大的缺失

在最近的出版物中，Ma等人报道了使用CRISPR-Cas9基因组编辑"correction of a heterozygous paternally inherited MYBPC3 mutation in human zygotes"。 阿德莱德大学生物科学学院Thomas等人感兴趣地阅读他们的工作，特别是解释野生型母体等位基因被用作模板来修复突变位点的DNA断裂。 Thomas等人认为还有其他解释，特别是在突变位点修复CRISPR-Cas9单一切割产生大的缺失，阻止PCR扩增父本染色体，从而给出同源修复的外观。 Ma等人没有进行实验来排除这种可能性，因此Thomas等人试图在小鼠胚胎中测试这种观点，这种观点密切模拟了人类受精卵的发育。

总之，Thomas等人的数据表明，在CRISPR-Cas9单切割后小鼠受精卵中经常产生大的缺失，如最近其他人所述。 虽然物种差异可能会影响DNA修复产品，但Ma等人不能肯定地断定所谓的同源定向修复基因修正事件已经产生了纯合的野生型胚胎，直到排除了大量缺失的存在。 这可以通过产生如上所述的更大的PCR产物来研究。 定量PCR分析以确认两种野生型等位基因的存在将提供确凿的证据。 在人类种系修饰的背景下准确基因分型的重要性不容小觑。 未能检测到大的缺失可能会导致潜在的临床应用产生灾难性后果。

原文链接：Large deletions induced by Cas9 cleavage

3.先前研究：CRISPR编辑居然容易导致大片段缺失等严重问题

CRISPR-Cas9系统用于人类基因治疗的效用已得到认可和广泛研究。通过开发敏感检测方法以及改进的Cas9酶和改进的限制此类损害的递送方案，解决了对脱靶活性的初步担忧。 Cas9切割后在各种细胞类型中绝大多数的靶向DNA修复结果被认为是小于20bp的插入和缺失（插入缺失）。虽然在使用Cas9或其他核酸酶的实验中也观察到大小数百个核苷酸的插入缺失，但据报道它们是罕见的。

使用配对的gRNA诱导局部缺失的研究也报道了更复杂的基因型的产生，例如倒位，内源和外源DNA插入，以及大于预期的缺失。单个gRNA显示在小鼠受精卵中诱导高达600bp的缺失。已经描述了可能由单个gRNA诱导的单倍体癌细胞系中高达1.5kb的缺失。此外，在大多数研究中，使用单一和成对gRNA产生的等位基因的分析依赖于靶标周围和潜在脱靶位点的短区域（<1kb）的扩增，限制了评估范围。与切割位点不相邻的病变，例如在I-SceI核酸酶切割时在酵母中报道的病变，也会被这种短程评估错过。最后，其基因组和DNA修复机制异常的癌细胞系经常用于研究Cas9诱导的病变，使得对正常组织和细胞的外推成为问题。

基于以上问题，英国Wellcome Sanger 研究所Bradley研究组报告了显著的靶向诱变，例如小鼠胚胎干细胞，小鼠造血祖细胞和人分化细胞系中靶向位点的大缺失和更复杂的基因组重排。 使用长读取测序和长程PCR基因分型，Bradley研究组显示由单指导RNA / Cas9引入的DNA断裂经常解析为延伸超过许多千碱基的缺失。 此外，确定了切割部位远端的病变和交叉事件。 由CRISPR-Cas9编辑引起的有丝分裂活性细胞中观察到的基因组损伤可能具有致病后果。

本研究中的编辑是在正常ES细胞和祖细胞中的活跃转录基因座上进行的，两者都具有完整的DNA修复过程，以及永生化的分化的人细胞系;每个都是各种临床编辑应用的细胞系。Bradley研究组表明，广泛的靶向基因组损伤是所有基因座和所有测试细胞系的共同结果。此外，观察到的遗传后果不仅限于目标基因座，因为诸如杂合性丢失之类的事件将揭示隐性等位基因，而易位，倒位和缺失将引起远程转录后果。

鉴于目标基因座可能具有转录活性，将其与数百种癌症驱动基因之一并列的突变可能会引发肿瘤形成。在编辑数十亿个细胞的临床背景下，产生的大量不同突变使得每个方案中的一个或多个编辑细胞可能被赋予重要的致病性病变。这种病变可能构成干细胞和祖细胞中的第一次致癌过程，其具有长的复制寿命并且随着时间的推移可能变成肿瘤。这种情况类似于在一些早期基因治疗试验中通过前病毒插入激活LMO2，这些试验在这些患者中引起癌症。此处报道的结果还说明了在离体进行编辑时需要彻底检查基因组。由于遗传损伤是常见的，广泛的，并且通过常用的短程PCR检测不可检测，因此需要进行全面的基因组分析，以便在患者给药前鉴定具有正常基因组的细胞。

原文链接：Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

4.质疑2：人类受精卵中的同源修复？

开发和应用防止通过人类种系传播有害突变的方法将具有相当大的健康益处。 为了在人类胚胎中使用CRISPR-Cas9技术校正父系致病突变，Ma等人断言母体等位基因是用于基因校正的有效修复模板，包括当Cas9应用于中期II（MII）卵母细胞时。 

由于母系和父系基因组经历了不同的发育程序，并且在第一次有丝分裂之前处于不同的细胞核中，这似乎排除了同源间的相互作用，纪念斯隆凯特琳癌症中心Egli等人认为提供双链分子结果的综合分析至关重要。 在没有推断事件的直接分子证据的情况下，使用这些方法校正人类种系的考虑应该极其谨慎。

总之，基因校正的直接验证和排除其他可能的结果是任何将被考虑用于将来植入的胚胎的必要条件。 基因编辑有可能减少引起疾病的等位基因，但是人类种系的无意改变，包括重排，长期缺失和杂合性缺失，例如来自IH-HR，可能会产生严重后果，影响发育，易患癌症和生育能力。Egli等人对Ma等人的讨论表明需要对早期胚胎中的修复机制进行更全面的表征，并确定基因编辑在人类种系中的治疗用途的关键挑战：开发可靠的分析方法来区分在DNA限制时，不同的修复结果之间。

原文链接：Inter-homologue repair in fertilized human eggs?

5.作者回复

随附的两篇评论强调了Mitalipov等研究组最近的研究结果及其对理解DNA修复基础生物学和潜在的未来疗法的意义。根据Mitalipov等研究组的原始结果和本文提供的结果，Mitalipov等研究组建议人类胚胎具有非减数分裂同源染色体DNA修复的能力。必须进一步探索这种内源性修复能力，用不同的建立者突变进行复制，并且可能评估未来的种系基因治疗应用。关于在基于同源染色体的HDR和细胞周期定时期间涉及的精确机制，仍存在许多问题。

然而，鉴于这种DNA修复似乎在不同物种中广泛保守，深入的机制研究可能在模式生物中得到解决。事实上，bioRxiv最近的一篇文章使用更严格的分析证实了Mitalipov等研究组在小鼠中的发现。在此期间，Mitalipov等研究组希望Egli等人和Adikusuma等人提出的问题以及Mitalipov等研究组在此提出的新结果将有助于更好地理解DNA修复的复杂性，并作为进一步讨论的有用研究平台。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-018-0381-y