美国生殖生物学专家PK《Nature》 强力回应对基因编辑的质疑

去年，波特兰俄勒冈健康与科学大学生殖生物学专家Shoukhrat Mitalipov领导的中美韩三国科学家宣布，他们用CRISPR-Cas9基因编辑技术修复了人类胚胎可能导致心力衰竭的受损基因时，引起了批评人士对该报告的质疑。

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Shoukhrat Mitalipov（图片来源：geekwire）

针对该研究，8月8日发表在Nature上的两篇评论认为，胚胎可能尚未修复。同期发表在Nature上的还有Mitalipov等人的答复，他们一项后续研究表明基因编辑是成功的。

回顾：美国首次人类胚胎基因编辑

2017年7月，Mitalipov等人用CRISPR技术修复了父本存在MYBPC3基因突变的人体胚胎，继承这种基因的人经常会发生心力衰竭，通过切割基因允许细胞通过用正确的信息替换基因中来修复突变。

在之前的研究中，一般都是先对卵子进行受精，再注射Cas9酶和向导RNA进行基因编辑，但这种方法效率低下，因为后期胚胎混杂了被修复和未经修复的细胞，即出现了嵌合体现象。但Mitalipov等人的研究是在M期将CRISPR试剂与精子一同注入卵子中，进行突变基因的编辑。结果显示：在58个胚胎中，有42个完全消除了基因突变，成功率高达72%，而且没有发现脱靶现象。

视频显示CRISPR基因编辑试剂在受精时注入人体卵子，科学家使用该技术来纠正父亲精子中存在的DNA错误。（来源：Nature）【视频】美国科学家完成第一个基因编辑的胚胎尝试性研究

质疑的声音

此次，质疑的争议点在于基因修复的机制，因为Mitalipov等人本打算以小的外来DNA片段提供正确的基因信息，但胚胎忽略了该修复模板。相反，胚胎使用了野生型母体等位基因被用作模板来修复突变位点的DNA断裂，这种行为被称为基因转换。

基因转换是指一个DNA序列替换同源序列的过程，使得序列在转换事件后变得相同。基因转换可以是等位基因的，也就是说同一基因的一个等位基因可以替代另一个等位基因，也可以是异位，这意味着一个旁系同源的DNA序列可以转换另一个。

然而，这种现象通常发生在生殖细胞减数分裂时。受精后，卵子和精子的基因组位于受精卵的两端，每个细胞都会被膜结构包裹好几个小时，这一现象将使得CRISPR难以用母本同源序列来修复突变体父本等位基因。

因此，南澳大利亚健康与医学研究所的遗传学家Paul Thomas说，发现胚胎发生这种类型的修复是完全出乎意料的。

如果人类胚胎确实忽略了外来的DNA片段，这可能是胚胎基因编辑治疗遗传疾病的一个大问题，因为遗传疾病常常是在父母双方都带有错误基因时产生的。在那种情况下，没有健康版本的基因可以进行复制和粘贴。

然而，Thomas及其同事提出，Mitalipov的研究小组可能根本没有检测到基因转换，相反，带有突变基因的染色体可能是被大片的切除而不是被健康基因替换，但会让它看起来像发生了基因转换，愚弄研究人员认为已经修复了。

科学家们都不是省油的灯，说到做到。他们设计了实验，同样通过显微注射技术将CRISPR试剂送入小鼠的受精卵，使用了Cas9 mRNA而不是CAS9蛋白，因为这种方法已被证明能够高效地产生靶向突变，总共产生127个由每个gRNA显微注射的受精卵的胚胎。他们筛选了跨越gRNA靶位点的300-600个碱基对（bp）的聚合酶链反应（PCR）产物，并对PCR产物进行了Sanger测序。

结果显示，小鼠胚胎细胞和受精卵中CRISPR-Cas9介导的DNA切割后经常产生基因组的大片缺失。

在小鼠受精卵注射中检测到频繁的大片缺失

他们认为，虽然小鼠和人类胚胎细胞存在的物种差异可能影响DNA的修复，但Mitalipov的研究不能肯定所谓的同源定向修复基因校正事件已经产生了纯合的野生型胚胎。他们需要提供确凿的证据排除大片缺失的存在，并且通过定量PCR分析以确认产生两种野生型等位基因。

Thomas等人的疑虑不无道理，7月Nature上的一篇文章也提示CRISPR-Cas9技术可能导致广泛的突变和遗传损伤，其对基因组的造成的影响可能被“严重低估”。因此，在人类种系修饰的背景下准确基因分型的重要性不容小觑，未能检测到大片缺失可能会导致潜在的临床应用产生灾难性后果。

与Thomas一样，Dieter Egli等人也认为Cas9切割父本突变位点后导致的大片缺失能逃脱表征。

此外，他们还提出野生基因型可以通过Cas9注射期间卵的活化而产生，不一定成功整合了精子基因组，可能产生的是仅含有母本基因组的单倍体或二倍体孤雌生殖细胞。虽然Mitalipov等人通过细胞遗传学分析在胚胎产生的一些干细胞系中证实了父本基因组的贡献，但是没有确定野生型干细胞系是来自野生型精子，还是通过基因修正产生的。

父本基因组大片缺失以及孤雌生殖的可能

最新的证据：排除大片缺失

“Egli等人的批评并没有提出任何新的实验数据，他们仅仅基于纯粹的揣测而对我们的结果提出质疑。”Mitalipov在一份声明中反驳道。

他们认为，在原始研究中，特异于突变父本等位基因的CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）被递送到原核受精卵期或甚至在受精期间更早，因此父母同源物具有充分的物理相互作用和重组的机会。此外，Thomas等人使用的是Cas9 mRNA，加上物种差异都有可能影响编辑结果。

但口说无凭，研究结果胜于雄辩！

因此，为了排除大量缺失的可能性，Mitalipov等人决定对已发表的研究中的所有胚胎样本进行大规模的重新测试。不得不说，研究人员是很拼没错了。

之前的研究中，他们使用了PCR扩增MYBPC3突变位点向上下游跨越大约250bp的534 bp片段，并进行了Sanger测序。而这次，为了检测较大的缺失，研究人员重新设计另外8对长距离PCR引物，扩增成围绕MYBPC3突变基因的不同长度片段，范围从493bp到10,160bp。

跨越MYBPC3突变位点的8对长距离PCR引物

首先，他们重新测试了16个胚胎，分别来自野生型母本和父本基因型（WT/WT）、CRISPR-Cas9进行S期注射的（WT/WT）以及非注射对照胚胎的野生型母本和突变型父本（WT/Mut）。

在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，结果发现：所有16个样品中，引物PCR1、PCR2、PCR4和PCR5扩增了预期大小的单一条带，尽管引物PCR6和PCR7扩增后可检测到几个较小尺寸的微弱条带，但这些微弱条带的Sanger测序未产生任何可读产物，表明是非特异性PCR引物结合。

接下来，研究人员使用引物PCR3和PCR8对所有剩余WT/WT胚胎以及对照组进行了2次额外的长距离PCR扩增，结果发现：引物PCR3扩增产生了预期的1,742bp的单一条带；对于引物PCR8，除了与预期的10,160bp匹配的主要条带外，在一些靶向和对照样品中也可以看到一些微弱的较小尺寸条带，但同样地，Sanger测序表明非特异性引物结合。

最后，他们使用引物PCR3和PCR8扩增，测试了M期注射的WT/WT胚胎有无较大缺失，结果还是产生了预期的1,742bp或10,160bp大小的单一条带，即未能检测到大的缺失。

PCR样本的琼脂糖凝胶电泳结果

此外，全外显子组测序（WES）显示突变位点±5kb区域的测序深度没有差异，即没有任何大的缺失。

测序深度没有差异，排除大片缺失

 最新的证据：排除孤雌生殖

Egli等人推测此前M期注射组中嵌合胚胎的减少可能是由于受精失败导致孤雌生殖发育，Mitalipov表示这些杂合胚胎不能起源于孤雌生殖，因为他们都携带父本的MYBPC3缺失。

针对孤雌生殖发育的可能性，研究人员发现M期注射的卵母细胞表现出正常受精形态上有两个原核和两个极体，与具有孤雌生殖活性不一致，并且从非注射对照和S期注射胚胎中获得了类似的结果。

此外，M期注射组中的WT/WT胚胎的SNP分析结果清楚地证明了父本SNP（单核苷酸多态性）的保留。进一步地，短串联重复（STR）测定结果也证实包含母本和父本的STR等位基因。因此，鉴于在所有分析样本中检测到父本对基因组的贡献，可以排除孤雌生殖的可能。

MYBPC3 SNP分析

对此，其中一篇Nature的通讯作者、纪念斯隆凯特琳癌症中心的发育生物学家Maria Jasin认为：“新报告提供了更有说服力的数据，但我仍然表示怀疑，在小鼠实验中，基因转换这种类型的修复很少发生，没有理由认为人类胚胎更频繁地进行修复。当然，不能否定存在这种修复的可能性。”

Maria Jasin（图片来源：MSKCC）

结语

针对Nature同期发表的3片文章，乍一看是科学家们的互怼，但实际上代表着一种严谨的科学精神，也表明了胚胎基因编辑受到了很大的关注，大家都想在应用到人体试验之前，确保万无一失。

Jasin和Thomas说，虽然人们乐观地认为科学家能够修复人类胚胎中突变的基因，但研究人员还没有，考虑到基因编辑可能出现的所有问题，例如意外地进行突变，该技术是否有效存在着不确定的余地，人们离其安全性的100％自信还有很长的路要走。

来源：

Ma et al. reply

Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos

US scientist who edited human embryos with CRISPR responds to critics

Researchers say CRISPR edits to a human embryo worked. But critics still doubt it