《Cell》: 新技术揭示新生儿免疫系统发育模式

2018年，拓展质谱流式应用方向的文献频出。5月斯坦福大学Alex J. Kuo实验室将质谱流式研究引入表观修饰领域和衰老领域的热潮还未过去，8月瑞典皇家理工学院Petter Brodin实验室就实力抢镜，在Cell上发表其研究“Stereotypic Immune System Development in Newborn Children”，将质谱流式的热潮延续到新生儿免疫系统发育领域。

免疫系统的发育依赖于其暴露的环境因素。尤其是新生儿诞生后的前三个月暴露于什么样的环境中对于其免疫系统发育有重要的影响：肠道，皮肤，血管的微生物组成都在其中扮演了重要的角色。在此期间的免疫系统发育情况与后期过敏，哮喘，I型糖尿病等免疫相关疾病的发病都有相关性。因此，新生儿免疫系统发育一直以来都备受重视却又难有突破。其中很重要的一个原因是研究存在一个技术难点，那就是如何从新生儿如此少的血样中得到足够多的信息。在本文中，Petter Brodin实验室应用了质谱流式技术（每次可以检测40个通道以上）和ProSeek（Immunoassays，分析267种血浆蛋白）高通量的优势，克服这一难点。

该研究抽取了50个早产儿(＜30周)和50个足月新生儿(＞37周)出生时的脐带血及出生后1周、4周和12周的仅仅100ul血液，利用质谱流式技术就分析了58个常见免疫细胞亚群在人出生后不同时间点的发育情况，对比分析了早产儿和足月出生的新生儿之间的关系，并对影响免疫发育的因素进行了研究(图一)。同时结合immunoassays Proseek分析267种血浆蛋白表达情况，系统性呈现出新生儿出生后免疫系统适应性发育概况。结果显示：1 早产儿和足月新生儿在出生后免疫系统组成有着较大差异，之后，随着免疫系统的发育，两者的差异逐渐消失；2 免疫系统最初的发育遵循一个既定的路线；3 脐带血的免疫亚群组成对于新生儿的免疫系统无预示作用；4 与微生物的相互作用对免疫系统的发育有重要影响，肠道微生物的失调会阻碍发育进程。

图一:文章研究思路. 采用50个早产儿和50个足月新生儿出生时的脐带血及出生后的1周，4周和12周的100ul血液，利用质谱流式技术和Proseek对新生儿免疫系统发育以及环境对其的影响进行解析.

该研究对于质谱流式应用具有很大的推进作用——将样本量降低到仅仅100ul，而且在降低样本量的同时还可以维系PBMC分群得到常见免疫亚群中最为稀少的DC细胞亚群。其改良后的Protocol对于今后质谱流式的应用，尤其是样本量稀少的研究很有借鉴意义。该Protocol采用SmartTube或Cytodelics系列产品直接对血样进行裂红的方法代替常规Ficoll分离，降低了分离时所损失的细胞比例，提高了得率及活细胞比率。因此100ul血样中的PBMC就足以在保证罕见免疫亚群不丢失的情况下完成分群。在这里需要提出的一点是该Protocol的成功应用同时得益于其Panel设计。由于研究的是常见免疫亚群的发育情况，Panel中所涉及到的38种marker都是T细胞，B细胞，NK细胞，DC细胞等亚群激活，分化等分群常见的表面蛋白，而没有涉及到信号会受到SmartTube影响的趋化因子受体，磷酸化蛋白等抗原(图二)。用Immunoassay作为手段进行趋化因子等蛋白浓度研究。

图二:质谱流式Panel.

在研究的一开始，作者对早产儿和足月儿的脐带血中血浆蛋白浓度进行研究，发现早产儿的脐带血中的免疫系统有明显炎症反应特征：趋化因子CXCL11和IL8（CXCL8）高表达.而足月儿脐带血中存在adipokine leptin高表达，反映在孕期的最后三个月，胎儿体内进行大量的脂肪累积。脐带血的质谱流式分析显示早产儿和足月儿的免疫系统组成具有各自明显的特征：其主要的区别在于早产儿体内的嗜中性粒细胞比例偏低。之后作者对新生儿脐带血(或外周血)和出生后一周的婴儿血样中免疫系统进行相关系数分析，发现在分析的21个亚群中，只有6个亚群显示出相关性。在分析的81种血浆蛋白中，只有TNFRSF13B可以由脐带血进行预测。为了进一步验证两者相关性，作者采用Barnes-Hut SNE (bhSNE)和Jensen-Shannon距离(JS Distance)分析，发现无论是细胞组成，血浆蛋白浓度还是细胞表型都无法由脐带血作出预测。为了进一步研究整个免疫系统的发育过程，作者采用拓扑数据分析(TDA)对免疫系统发育初期的细胞频率，血浆蛋白浓度等各类数据进行综合系统性降维分析，使其可视化，并结合临床数据，比如妊娠年龄，分析他们的关联性。之后结合皮尔逊相关系数分析，创建了KNN图谱。这些分析得出无监管计算模式下免疫系统发育的多参数图谱。该图谱中，脐带血和新生儿外周血的簇群完全分离，说明脐带血和出生后免疫系统发育无相关性(原文Figure3A)。早产儿和足月儿的簇群在一开始完全分离，说明在出生时两者有着完全不同的免疫系统状态，但是随着年龄的增长，这些分支逐渐完全重叠，说明尽管起点不同，但两者的发育遵循着共有的轨道(原文Figure3B)。

作者运用ANOVA模式分析了脐带血和出生后不同时间点的血样中的10个主要免疫亚群，发现随着出生时间的延长，免疫发育遵循了相同的系统变化：嗜中性粒细胞的梯度递减和Naïve CD4、CD8阳性T细胞的增加(原文Figure4B)。跟脐带血比起来，新生儿的负向调控免疫亚群比如MDSC类似亚群逐渐减少。以上这些发现进一步表明，无论是早产儿还是足月儿，出生后免疫系统的发育都系统性遵循着类似的轨迹。

之后作者关心的一个问题是出生后前三个月新生儿暴露的环境因素，对于免疫系统发育的影响。因此作者下一步的研究是将新生儿不同发育时期的血样分别和其父母血样用bhSNE进行研究对比。发现如下，在出生时，新生儿体内的单核细胞表型跟其父母已无明显差异，之后随着发育的进程，Naïve B，NK细胞和DC细胞的表型差异逐渐消失，但是CD4、CD8阳性T细胞表型在研究所涉及的发育时间内依旧存在差异。这预示着不同免疫亚群发育遵循各自不同的轨道，出生后前三个月暴露于什么样的环境中对于Naïve B，NK细胞和DC细胞发育具有长期的影响。

文章结合多种高通量的研究方法，站在系统性的高度上，对于新生儿免疫系统发育过程进行细致研究。除了质谱流式技术以外，文中还采用了其他的一些研究方法，比如16s RNA Profiling研究肠道微生物对于免疫系统发育的影响，RNASeq对1周和12周的婴儿血液样本进行转录组分析等。结合所有发现，作者提出了一个环境因素如何影响免疫系统发育的假说(图三)。假设对于免疫系统输入一个刺激，诱发免疫系统整体会往一个方向做出反应。在此背景下，输入第二个与第一个刺激引发相反反应的刺激后，免疫系统会做出针对两个刺激的反应，但是这两种反应彼此限制。那么，如果刺激足够多，引发的表型可能性会减少，发育轨迹便可以预测。

图三: 新生儿免疫系统发育假说