Science：最小版的CRISPR系统

CRISPR领域有3位耳熟能详的“开创者”：张锋、Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier，无论是在学术界还是产业圈，三位“大神”都成果显赫！10月18日，Jennifer Doudna团队在《Science》期刊发表了最新研究成果，展示了最小版的CRISPR系统！

许多古生菌（Archaea）都存在CRISPR系统，用于保护自身免于病毒的攻击。它们会利用天然的Cas蛋白质，用于“撕碎”入侵的病毒DNA。其中，最主流的Cas酶是基础版酿脓链球菌Cas9酶（SpCas9）。

随着研究的深入，科学家们还找到其他成员：靶向RNA的基因编辑酶C2c2（Cas13a）、靶CasRx（Cas13d）以及有任意切割单链DNA潜能的Cas12a（Cpf1）。此外，还有Cas14，迄今为止最小版的Cas蛋白。

DOI: 10.1126/science.aav4294

Cas14

尽管研究人员一直在寻找可以添加到“基因编辑工具箱”中的Cas蛋白，但是Cas14却被忽视了。因为相比于其他Cas酶，它太小了，以至于被认为不能与其他蛋白协同工作。

来自加州大学伯克利分校的CRISPR “女神”Jennifer Doudna及其团队却没有放弃它。他们筛选了数万个基因组（来源于各种环境样本的宏基因组测序结果），从中发现了Cas14。

Doudna团队认为，Cas14具有作为生物技术工具的潜力。正是因为体积小，Cas14有望在小细胞或某些病毒中发挥基因编辑的作用。但是，考虑到其切割单链DNA的活性，Cas14更有可能应用于CRISPR快速诊断系统，用于诊疗传染病、基因突变和癌症。

许多古生菌（Archaea）都存在CRISPR系统（图片来源：UC Berkeley）

最新发现

Cas蛋白会在gRNA的指引下与特定DNA结合，并对其剪切。通常，Cas酶相对较大（950-1400个氨基酸，SpCas9蛋白由1,368个氨基酸组成），但是Cas14特别精致，仅有400-700个氨基酸。

“虽然Cas14蛋白体积小，但是它能够在没有限制性序列要求的情况下进行定向单链DNA（ssDNA）切割。此外，Cas14的目标识别会带来ssDNA分子的非特异性切割，这是一种能够实现高保真SNP基因分型（Cas14-DETECTR）的活动。”研究人员解释道。

而且，Cas14与Cas12a、Cas13a相似，在与目标DNA序列结合后，开始不加区别地切割细胞内的所有单链DNA。相比之下，Cas9只结合并切割目标DNA。也就是说，Cas14和Cas12a一样，具有靶向依赖性的非特异性脱氧核糖核酸酶活性。

用途：即时诊断

值得一提的是， Doudna团队曾重点分析过Cas12a，首次发现这一酶可以对所有的单链DNA进行任意切割。基于这一特点，Doudna团队开发了一种诊断系统——DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，DETECTR，用于对临床样本中的少量DNA进行快速、简便地即时检测，适用于癌症和传染病等用途。相关研究成果于今年2月发表在《Science》期刊上。

现在，这一篇最新研究为DETECTR增添了新的“利器”：与Cas12a一样，Cas14同样可以用于核酸检测。

虽然肆意切割DNA在治疗上可能是一个缺点，但是对于诊断而言却是一个很大的优势。Cas14蛋白可以与附着在单链DNA上的荧光标记物配对。当Cas14与目标DNA（可以是癌症基因，也可以是细菌基因）序列结合并开始切割DNA时，它也会切断与标记物连接的DNA，产生荧光信号。

“与Cas12相比，Cas14靶向单链DNA的方式要更特别。”文章作者 Janice Chen表示道，“这是一个出乎意料的发现。因为它很小，我们几乎不认为它能工作，但实际上，它是超特异性的，这使它成为诊断工具箱中真正强大的补充。”

完善CRISPR队伍

“对于分子诊断，我们希望可以识别双链DNA、单链DNA和RNA。” Doudna团队的研究生Lucas Harrington表示道，“Cas12a非常擅长靶向双链DNA，Cas13则擅长RNA识别，现在识别单链DNA的Cas14的加入让队伍更完善了。”

研究人员认为，体积较小的Cas14似乎是更大、更复杂的Cas9和Cas12a蛋白质的更原始版本。这意味着，这些分子在经历漫长的进化后，变得更加专门化。

他们希望，从这些天然的Cas酶中设计出更为精致、高效的基因编辑器。“借助于宏基因组测序技术，我们挖掘了40多种CRISPR-Cas14系统和8种不同的亚型，这为研究新的CRISPR系统提供了线索。” Lucas Harrington总结道。