Nature综述: 磷酸酶的”不可成药“性正在被打破

磷酸酶（phosphatases）的作用是将多种蛋白质上的磷酸基团去掉。很久以来，它们已经被证明与肥胖症、糖尿病、癌症、神经退行性疾病等疾病有关。虽然和它们相对应的蛋白激酶已经是十多个FDA批准药物的靶点，但是安全有效的磷酸酶抑制剂仍然难以寻觅。

这种状况正在改变。目前至少有6个磷酸酶抑制剂在临床试验中接受检验。近日《Nature Reviews Drug Discovery》上刊登的一篇文章描述了这一领域的突破性进展。虽然大多数小分子药与它们靶点的活性位点相结合，这些磷酸酶抑制剂的作用方式却是与活性位点之外的别构（allosteric）位点相结合。别构抑制可能是打破磷酸酶“不可成药”性的成功策略。

磷酸酶“不可成药”性的由来

蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的经典范例是PTP1B。这一蛋白让PTP家族担上了“不可成药”的名声。在上世纪80年代，美国冷泉港实验室的Nick Tonks博士发现了PTP1B，随后的研究表明它能够调控胰岛素敏感性。对于Tonks博士来说，能够阻断PTP1B从酪氨酸上去除磷酸基团活性的抑制剂有着非常明显的抗糖尿病潜力。

然而要达到这一目标，研究人员需要先证明这个蛋白家族的功能不只是常规性地清理蛋白激酶留下的磷酸基团。很多研究人员担心抑制磷酸酶会对多种不同信号通路产生影响，导致严重副作用。但是到上世纪90年代末，PTP1B缺失的动物模型表明，抑制磷酸酶可以产生“高度特异性表型”。两款独立生成的PTP1B缺失小鼠模型表明，PTP1B失活可以提高胰岛素敏感度，而且让动物对饮食导致的肥胖产生抗性。

这时候医药公司已经争先恐后地开始以PTP1B作为靶点进行药物研发。然而药物研发过程困难重重，磷酸化的酪氨酸是一个极性底物，这意味着能够与PTP1B活性口袋相结合的配体也大多是极性分子。这导致筛选出来的化合物通常不适合口服，生物利用度低，而且不容易穿过细胞膜。

只有少数几个公司能够坚持将研发过程推动到临床后期，惠氏（Wyeth）公司将它的候选药物推进到2期临床，但是由于疗效不足和副作用的原因在2002年停止开发。重复的失败让研发人员对这一蛋白家族的兴趣不断减弱。“人们对活性口袋的研究已经很彻底了，” HotSpot Therapeutics公司联合创始人兼首席科学官Geraldine Harriman博士说：“我不认为以这类蛋白的活性口袋为靶点有任何光明的前景。”

在这些研究中的一个特例是Aerpio Pharmaceuticals公司的AKB-9778。它与VE-PTP的催化位点相结合。通过直接皮下注射药物来治疗糖尿病性视网膜病变，它避开了口服递送药物面对的挑战。

别构抑制策略带来新的希望

当以PTP活性位点为靶点的研究不断碰壁时，使用别构抑制策略抑制SHP2磷酸酶的进展让人们重新燃起了对PTP家族的希望。

SHP2是一个久经验证的PTP癌基因，它正在成为一个令人关注的癌症靶点。一部分原因是SHP2是多条激活RAS的信号通路汇聚的节点， 而RAS的激活对癌细胞的生长和存活都非常重要。“几乎所有受体酪氨酸激酶（RTK）以激活SHP2为主要途径，甚至是唯一途径来激活RAS，”Revolution Medicines公司的首席执行官Mark Goldsmith先生说：“因此SHP2抑制剂可能在这个关键节点上将那些不同的RTK基因突变一网打尽，用一个分子抑制所有活性。”

由于蛋白激酶与SHP2信号通路的重叠，SHP2抑制剂可以与激酶抑制剂联用对相互连接的信号通路进行双重抑制。这种组合疗法可能比单一疗法更为有效，而且让肿瘤不易产生药物抗性。最近在《Nature Medicine》上发表的一项研究中，研究人员表明对ALK抑制剂产生抗性患者的细胞，在接受ALK和SHP2抑制剂联用治疗后，对ALK抑制剂重新敏感。“我认为这可以适用于多种蛋白激酶。”Goldsmith先生说。

而且，SHP2与免疫检查点蛋白PD1相互作用，可以调节T细胞的活性。虽然这一功能的重要性还仍未确认，但是最近的一篇《Cell》科学论文显示SHP2抑制剂可能有提高T细胞免疫疗法的潜力。

诺华（Novartis）公司是第一个成功靶向SHP2的公司，该公司在2016年《自然》杂志上发表的研究表明，小分子抑制剂SHP099能够将致癌的磷酸酶固定在失活的构象上。由于靶向催化中心的磷酸酶抑制剂存在的极性和生物利用度方面的问题已经为人所知，诺华公司的研发项目一开始就以别构抑制为目标。

他们设计了一种筛选测试，旨在发现能够与全长SHP2结合的小分子。用第二种筛选找出能够与这一磷酸酶的活性位点相结合的小分子。然后将与活性位点结合的小分子从第一种筛选的结果中刨去。这样研究人员可以从剩下的小分子中发掘别构调节因子。诺华开发的TNO155在2017年已经进入治疗实体瘤的1期临床试验。

“我认为使用排除法的药物开发手段来靶向其它蛋白是一种可行的策略，”诺华公司的资深科学家Matt LaMarche博士说：“如果你能够设计出一种检测，将你不想要的分子过滤掉，你就可以简化筛选模式。”

诺华的研究团队已经又设计出一种检测，可以刨除与SHP009结合位点结合的小分子，这让他们发现了另一个别构化合物，它可以与SHP2的另一个别构位点相结合。

这些研究项目让LaMarche博士对发现磷酸酶抑制剂的可能性产生了新的领悟。“如果是探索别构机制的话，我会愿意开发磷酸酶的靶向抑制剂。在开发别构磷酸酶抑制剂的项目中，你在重新书写药物发现的准则，这是非常令人兴奋的事。”

别构抑制剂的利与弊

然而别构抑制剂的药物发现策略也有自己的缺陷，其中包括时间和资本上的投入更高。部分原因是使用全长蛋白进行筛选比使用催化亚基更具有挑战性，全长蛋白更容易从溶液中沉淀出来，聚集，或者出现物理化学方面的异常行为。而且即便发现了好的别构先导化合物，弄清它与靶点蛋白的结合位点也并不容易，这让详细阐明化合物的作用机制和理解结构与活性之间的关系变得很具挑战性。已有的小分子筛选库可能更富含与活性位点结合的化合物，因而可能不利于筛选别构抑制剂。

然而，在适合的情况下，例如发现用其它方法无法成药的靶点的抑制剂，这些投入是值得的。而且，别构抑制剂除了扩展靶点空间以外，还能带来其它益处。例如，所有PTP的活性位点都需要与磷酸化的酪氨酸结合，不同PTP之间的活性口袋非常类似。这意味着很难发现特异性抑制一个PTP而不对其它PTP产生影响的小分子。而不同磷酸酶的别构位点不见得是保守的，因此药物研发人员可以将别构抑制剂的特异性提高一个层次。Tonks博士希望别构药物发现的策略可以最终带来PTP1B抑制剂。在2014年，他发现一个称为trodusquemine的PTP1B抑制剂可能在HER2阳性乳腺癌中具备疗效。

DepYmed公司获得了开发这一药物治疗癌症的研发权。虽然该公司在2017年停止了开发这一药物的1期临床试验，但是它正在开发新一代别构分子DPM-1001在多种适应症上的应用。

“让我非常兴奋的是我们可以扩展PTP1B抑制剂的应用领域，它不但可以用于治疗癌症、糖尿病和肥胖症，还可以治疗神经系统的疾病。“Tonks博士说。在2015年，他的研究表明PTP1B可能成为治疗Rett综合征的靶点，这是一种神经发育疾病。

▲磷酸酶抑制剂研发管线部分项目

充满潜力的磷酸酶抑制剂领域

磷酸酶抑制剂领域仍然充满了机会。基因泰克公司的研究人员去年对磷酸酶进行了基因组和进化分析，他们发现了189个已知或可能编码人类磷酸酶的基因。其中40（21%）个在癌症、神经退行性疾病、耳聋和糖尿病等疾病中有和疾病相关的变异。

工业界对PTP在疾病中的功能非常重视，而别构抑制剂不仅可以打破PTP的不可成药性，还可能拓展丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PPP）抑制剂的开发。

PPP抑制剂的研发需要面对和PTP不同的挑战。PPP蛋白是由多个亚基构成的全酶，它的催化亚基通过与调控亚基相结合来赋予全酶的底物特异性。因此上百个不同PPP全酶的催化亚基都是保守的。这导致PPP抑制剂的风险是可能全面阻断所有的去磷酸化。在上世纪90年代开发的PP1PPP催化抑制剂“杀死细胞的速度比任何我曾经放到培养皿里的有毒物质都快。”分子生物学家Anne Bertolotti博士说。

然而Bertolotti博士发现了筛选具有选择性的PPP抑制剂的方法。通过筛选防止蛋白受错误折叠影响的分子，她幸运地发现一个具有选择性的PPP抑制剂，这项工作在2011年发表在《科学》期刊上。随后的研究带来了这一化合物的改良衍生物——Sephin1。它在临床前研究中表现出治疗腓骨肌萎缩症（Charcot–Marie–Tooth）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）的潜力。InFlectis BioSciences公司将这款PPP1R15A抑制剂推进到1期临床试验，现在它的名字叫IFB-088。

Bertolotti博士随后将她的平台用于发现与非催化区域结合的PPP抑制剂。在今年早些时候发布在《Cell》上的研究中，她证明PPP的全酶可以在表面等离子共振芯片上组装，它们可以用于筛选结合化合物。而使用相关的全酶进行反向筛选可以去除那些没有特异性的化合物。作为概念验证，Bertolotti博士和她的同事发现了Raphin1，这是一个PPP1R15B的小分子抑制剂，它可能是治疗亨廷顿病的候选药物。

Bertolotti创建了Camphos Therapeutics公司，使用同样的筛选策略来发现其它PPP全酶的特异性抑制剂。与PTP相比，PPP调控几乎所有的生物过程，因此具有更大的治疗潜力。

“我曾经以为这是一个疯狂的挑战，我在尝试一个不可能完成的任务，”当Bertolotti博士回顾最初研究PPP家族蛋白的决定时说：“但是我是生物化学家出身，能够研究一类我们一无所知的蛋白酶绝对是非常让人着迷的事。”

参考资料：

Phosphatases start shedding their stigma of undruggability