如何使用免疫组合疗法治疗“冷肿瘤”和“热肿瘤”？

在过去几年里，癌症免疫疗法和免疫检查点抑制剂的诞生给肿瘤学领域带来了革命性的变化。虽然免疫检查点抑制剂的卓越疗效展示了人体免疫系统在对抗癌症方面的巨大潜力，但是很多癌症患者对这一创新疗法并没有响应。近些年来，人们经常会听到肿瘤可以分为“热”肿瘤和“冷”肿瘤两大类型，这两种类型的肿瘤有什么区别？对它们的治疗方法有什么不同？有哪些手段可以提高癌症免疫疗法对“冷”肿瘤的疗效？近日《Nature Reviews Drug Discovery》上发表的一篇综述对这些问题进行了详细的解答。今天我们将和读者分享这一综述中的重要内容。

什么是“热”和“冷”肿瘤？

目前对肿瘤和免疫系统之间相互作用的理解为将肿瘤根据其免疫特性进行分类提供了良好的基础。已有重要研究表明，在结直肠癌患者中，在肿瘤病灶处的免疫细胞的类型、密度和所处位置可以准确地预测患者的生存。这一研究导致了肿瘤免疫评分（Immunoscore）的产生。这一基于共识的标准化评分系统通过对肿瘤中心和肿瘤边界（又称为浸润切缘，invasive margin）区域中的CD3+，和CD8+两种淋巴细胞的量化统计，可分为4级。免疫评分为0的肿瘤在肿瘤中心和边界区域都没有CD3+和CD8+淋巴细胞，而免疫评分为4的肿瘤在肿瘤中心和边界区域都存在高密度的CD3+和CD8+淋巴细胞。

目前人们经常提高的“热”肿瘤和“冷”肿瘤指的是出现淋巴细胞浸润和炎症的肿瘤和没有淋巴细胞浸润和炎症的肿瘤。这两个概念与分数为4和分数为0的肿瘤有较好的对应关系。然而，除了“热”和“冷”肿瘤以外，根据肿瘤的免疫特征，它们还有其它两种类型：一种称为“排除型”（excluded），这种类型的肿瘤边缘存在大量CD3+和CD8+淋巴细胞，但是这些细胞无法浸润到肿瘤中心。另一种称为“免疫抑制型”（immunosuppressed），这种类型的肿瘤的中心和边缘区域虽然都有淋巴细胞，但是细胞的密度不高。

▲不同免疫类型的肿瘤分类以及它们对免疫检查点抑制剂疗法的敏感性

癌症免疫疗法与已存在的免疫反应之间的关系

免疫调节策略的有效性与已存在的基线抗肿瘤免疫反应水平息息相关。对目前的免疫检查点抑制剂疗法的一个常见的比喻是它们去掉了免疫反应的“刹车”，但是这个比喻意味着原先“车子”是能往前跑的，如果原先“车子”没有油了，根本就不会动，去掉“刹车”还是不会让它跑起来。

已有的临床研究表明，接受治疗之前，在肿瘤局部或者在血液循环中已经存在的抗肿瘤免疫活性水平，对随后的免疫检查点抑制剂疗法的疗效起到重要作用。而效应T细胞的活性是抗癌反应的核心。CD8+ T细胞当识别肿瘤抗原后，能够通过释放大量细胞毒性因子来杀伤肿瘤细胞。在转移性黑色素瘤患者中，在肿瘤边缘出现CD8+ T细胞是PD-1阻断能够产生疗效的先觉条件。而且，在产生响应的患者中，这一CD8+ T细胞群体的增殖与肿瘤的缩小有直接相关关系。通过打破免疫耐受，免疫检查点抑制剂能够释放已经存在的免疫反应来杀伤肿瘤，但是如果没有已经存在的免疫反应，免疫检查点抑制剂则没有效果（比如“冷“肿瘤和“排除型”肿瘤）。

作为单药疗法，免疫检查点抑制剂的响应率在10-35%之间。大多数四期实体瘤在被确诊时，原发瘤中没有或只有很少浸润的T淋巴细胞，这可能为患者对免疫检查点抑制剂的响应率提供了部分的解释。为了提高这类疗法的临床效益，医药界展开了非常多的研究和临床试验来检验将不同免疫疗法进行组合的疗效，组合疗法还包括将免疫疗法与标准疗法联用。根据肿瘤是“热”还是“冷”肿瘤，这些组合疗法的疗效也会有所不同。

▲在临床试验中接受检验的癌症免疫疗法一览

“热”肿瘤的治疗方法

靶向T细胞的免疫疗法

“热”肿瘤因为已经包含大量的浸润T细胞，它们是免疫检查点抑制剂疗法和组合疗法尝试的热点。耗尽或功能失常的肿瘤浸润淋巴细胞通常表达一系列免疫抑制受体，包括CTLA4和PD-1。靶向PD-1和CTLA4的疗法已经获得FDA批准，而且由于CTLA4和PD-1作用方式不重叠，它们是使用双重免疫检查点阻断的好靶标。确实，抗CTLA4和PD-1的双重阻断疗法已经在治疗晚期黑色素瘤，非小细胞肺癌，和肾细胞癌方面已经取得了成功，并且获得了FDA批准。不过这些组合疗法可能只会在“热”和“免疫抑制型”肿瘤中产生效果，因为它们依赖于一定水平的浸润T细胞的存在。

其它可以与PD-1药物构成组合的疗法包括靶向LAG3，TIM3， TIGIT的疗法。这些靶点都属于T淋巴细胞的共抑制受体。

另一种组合方法是将免疫检查点抑制剂与靶向共刺激受体的药物联用，这些共刺激受体包括OX40抗原（又名TNFRSF4或CD134）， TNFRSF7（又称为CD27），CD28， TNSFRSF9（又称为4-1BB配体受体或CD137），以及GITR。这些受体的作用都是增强T细胞扩增和效应子功能，同时控制调节性T细胞的免疫抑制功能。

调控微生物组

抗生素在晚期癌症患者中可能抑制免疫检查点抑制剂的疗效，有试验表明对免疫检查点抑制剂的反应和革兰氏阴性共生菌Akkermansia muciniphila的水平相关。因此，有选择性地对肠道微生物种群成分的调节可能帮助克服对免疫检查点抑制剂的抗性。“好”细菌的数量增多与在血液循环中CD4+和CD8+ T细胞的数量增多相关，在黑色素瘤患者中，它们与对抗PD-1疗法的响应也相关。

单靠调节微生物组可能对非“热”肿瘤产生疗效，但是现有证据表明，通过相对简单的生活习惯改变或服用“好”细菌可能帮助提高随后的免疫疗法的效率，特别是对“热”肿瘤患者来说。

治疗“排除型”和“免疫抑制型”肿瘤的疗法

T细胞运送调控剂

在“排除型”肿瘤中，CD8+ T细胞会在肿瘤边界聚集。这意味着宿主能够产生T细胞介导的免疫反应，但是T细胞无法侵入到肿瘤内部。这一现象可能有很多解释。一个原因T细胞被排除在外可能是由于缺少募集T细胞的信号，包括知道T细胞运送的趋化因子。它们包括CXCL9， CXCL10， CXCL11， CCL2和CCL5等等。肿瘤中出现的基因和表观遗传变异可能抑制了它们的表达。可以想见，促进T细胞募集的治疗策略可能在“排除型”肿瘤中克服对免疫检查点阻断的抗性。

目前的研究表明，使用表观遗传学调控剂提高肿瘤表达的趋化因子，和阻断β-连环蛋白信号通路，都能够募集更多T细胞，将“排除型”肿瘤变为“热”肿瘤，从而提高共同进行的免疫疗法的成功率。

破除物理和生化屏障

T细胞不能进入肿瘤的另一个原因可能是物理和生化障碍。肿瘤的另一个标志性特征是产生异常组织结构。肿瘤的血管网络和很多细胞外基质蛋白的表达都发生了显著变化。肿瘤的血管网络通过导致黏附分子的调控失常防止T细胞的迁移，这是T细胞浸润的一大障碍。肿瘤增生造成的缺氧环境也有利于产生免疫抑制的肿瘤微环境，缺氧的作用主要依靠HIF转录因子家族的作用。另一提高肿瘤微环境免疫抑制特性的信号通路ATP-腺苷信号通路。肿瘤中存在的CD39和CD73酶能够将ATP转化为腺苷，细胞外腺苷水平的升高可以产生一系列免疫抑制作用。

针对这些因素，靶向HIF，CD73， CD39和腺苷受体的抑制剂或者单克隆抗体已经被开发出来，它们正在不同临床阶段接受检验。

另一种改变肿瘤微环境的方法是将肿瘤周围的血管网络正常化。血管网络正常化可以减少缺氧环境，提高1型辅助T淋巴细胞的浸润和活性。因此抗血管增生疗法与免疫检查点抑制剂疗法的联用可能产生协同效应。

克服可溶性免疫抑制因子

在“免疫抑制型”肿瘤中，肿瘤病灶处出现免疫浸润，但是免疫浸润的程度不高，这意味着可能有广泛的免疫抑制环境，而不是物理屏障在阻碍T细胞的募集。IL-10和TGFβ是目前研究最为广泛的两种阻碍抗癌免疫反应的可溶性因子。IL-10和TGFβ的功能之一是阻碍树突状细胞的分化、迁移和抗原呈现。这些功能对产生有效的抗肿瘤T细胞免疫反应至关重要。最近TGFβ抑制剂与抗PD-L1疗法构成的组合疗法在临床试验中表现处了一定疗效。

调控局部适应性免疫反应的调控细胞

在肿瘤微环境中抑制局部适应性免疫反应的两类重要细胞是调节性T细胞（Treg）和髓源性抑制细胞（MDSC），因此，药物研发人员正在探索靶向这两类细胞的策略。特异性靶向在髓细胞中高度表达的PI3Kγ能够重塑肿瘤微环境，并且在小鼠癌症模型中提高细胞毒性T细胞介导的肿瘤缩小。这类药物与PD-1阻断疗法构成的组合疗法目前正在临床试验中接受检验。其它消除髓源性抑制细胞的策略也取得了不同程度的成功。

▲针对不同免疫类型的肿瘤的疗法策略图

治疗“冷”肿瘤的方法

肿瘤免疫评分为0的“冷”肿瘤，是最难于清除的肿瘤类型，它们通常与预后不良相关。克服缺乏已存在的免疫反应，将“冷”肿瘤变为“热”肿瘤的策略，是将提高T细胞反应的触发疗法（例如肿瘤疫苗），与消除共抑制信号的疗法（例如免疫检查点抑制剂或髓源性抑制细胞清除）和提高共刺激信号的疗法相结合。这种多重疗法组合策略的风险是组合疗法的毒副作用也会同时增加，因此，对这些组合疗法需要进行非常严格的评估。

放疗

一种有望与免疫疗法联用的触发疗法为电离放疗。目前放疗递送的精准度和导致的对免疫原性细胞希望信号通路的激活可能将肿瘤变为原位疫苗，从而不但能够起到局部消灭肿瘤的效果，还能通过提高免疫反应对远端肿瘤产生影响。放疗介导的细胞损伤释放的DNA可以导致STING介导的1型干扰素的生成，而这会提高T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。这一过程需要CD103+树突状细胞对肿瘤的浸润，因此对“冷”肿瘤的效果有限，但是对“排除型”肿瘤应该有效。放疗与抗CTLA4抗体构成的组合疗法已经在治疗黑色素瘤和NSCLC方面显著改善了治疗效果。

化疗

基因毒性化学疗法可以导致肿瘤细胞出现更多基因突变，从而产生新表位，这会增强肿瘤细胞的免疫原性。然而，这些新抗原可能在肿瘤细胞中表达的水平很低，从而对免疫反应的影响不一定恨到。即便如此，能够导致免疫原性细胞死亡的化疗药物（包括蒽环类药物，环磷酰胺，紫杉醇等）能够通过释放损伤相关的分子模式（DAMPs）和激发凋亡信号通路等方式提高佐剂效应（adjuvanticity）。已有研究表明，在乳腺癌患者中进行的新辅助化疗（NAC）可以提高肿瘤内CD8+ T细胞与FOXP3+ 细胞的比例，而且抗癌T细胞的扩征与对NAC的反应相关。

化疗还可能通过脱靶效应激活免疫效应子，从而导致广泛的免疫激活。目前积累的证据表明，化疗不但能够抑制肿瘤生长，还能够在正向调节免疫系统方面起到重要作用。

靶向疗法

肿瘤相关抗原（TAA）负荷不足理论上会妨碍有效T细胞介导的免疫反应的产生。因此，提高肿瘤免疫原性的疗法可能会对T细胞募集有益，从而提高肿瘤杀伤效果。促使肿瘤细胞表达TAA的疗法可以提高肿瘤免疫原性。这些疗法包括DNA去甲基化药物，或者EGFR和MEK抑制剂。这些药物的一个共同功能是能够提高呈现抗原的MHC I复合体的表达，从而提高癌症抗原的呈现。

▲治疗“冷”肿瘤的不同策略

基于DNA修复的疗法

高突变负荷和预期的高新抗原负荷在肺癌和黑色素瘤患者中与免疫检查点阻断疗法的临床效益相关。因此，提高肿瘤细胞中新抗原负荷的疗法理论上可以与免疫检查点抑制剂联用。在小鼠研究中，在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞中导致DNA错配修复（MMR）机制的失活可以引发基因组不稳定性，并且触发免疫监察的发生。这项研究不但表明了新抗原负荷的重要性，而且指出抑制DNA损伤反应（DRR）对免疫疗法的潜在影响。目前有多项阻断DDR系统的药物在临床前和临床期接受检验。

CAR-T疗法

CAR-T疗法是目前癌症免疫疗法的另一大新兴领域。在治疗血癌方面CAR-T疗法已经获得出色的疗效。对于“冷”肿瘤来说，关键问题是CAR-T疗法能否将“冷”肿瘤变为“热”肿瘤。从目前的试验结果来看，单靠CAR-T细胞可能无法完成这项任务。在不存在炎症性T细胞的小鼠黑色素瘤模型中，注入的CAR-T疗法无法运送到肿瘤部位，由于肿瘤部位缺乏募集T细胞的CXCL9和CXCL10趋向因子。

溶瘤疗法

溶瘤病毒是天然或者基因工程改造的病毒，它们能够有选择性地感染并且在肿瘤细胞中复制，最终导致肿瘤细胞裂解。除了直接和局部的抗肿瘤活性以外，溶瘤病毒还可以激发强力，全身性，并且可能持久的抗肿瘤免疫反应。濒死的肿瘤细胞会释放TAAs和DAMPs，从而激发有效地抗肿瘤免疫反应。

溶瘤病毒需要在保留刺激免疫系统能力的同时，消除毒力因子，才能作为疗法使用。很多在研病毒在临床试验中接受检验，其中包括腺病毒、HSV-1、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒等等。很多在研溶瘤病毒对在肿瘤细胞表面光过度表达的细胞表面蛋白具有天然的趋向性。例如，CD46和HVEM分别是麻疹病毒和HSV-1病毒进入细胞的受体。

T-VEC病毒是第一款FDA批准的治疗无法切除黑色素瘤的溶瘤疗法。一个将“冷”肿瘤“加热”的治疗策略是用溶瘤病毒作为触发疗法，将它与消除共抑制信号的疗法相结合。在临床试验中，T-VEC与ipilimumab在无法切除的黑色素瘤患者中联用的抗癌活性强于ipilimumab单药疗法。在另一项1b期临床试验中，先使用T-VEC，然后使用抗PD-1抗体pembrolizumab在晚期黑色素瘤患者中达到高达62%的响应率。

基于肿瘤疫苗的疗法

在发现肿瘤细胞中的新抗原之后，这些新抗原或者新抗原表位可以通过不同的平台被呈现出来，包括使用肿瘤细胞提取物，RNA或DNA编码的部分或全部蛋白，或者在树突状细胞中表达的重组病毒或细菌载体。额外添加疫苗佐剂可以进一步增强对TAA的免疫反应。虽然理论上肿瘤疫苗似乎非常有价值，但是在多项临床试验中它们的表现缺差强人意。这让科学家们致力于揭示肿瘤疫苗效力不强的原因。一个需要考虑的重要因素是抗肿瘤疫苗在已经被确诊携带肿瘤的患者中接受检验，而这时候肿瘤的免疫抑制机制已经在发挥作用。

因此，免疫检查点抑制剂的成功给肿瘤疫苗疗法带来了新的希望。免疫检查点抑制剂的临床研究表明体细胞突变负荷和随后具有临床益处的新抗原的出现之间存在正相关关系。这为将免疫检查点抑制剂与激发T细胞的抗癌症疫苗联用提供了理论基础。免疫检查点抑制剂可以提供类似于疫苗佐剂的作用。这种组合有可能为携带“冷”肿瘤的患者提供益处。

开发抗癌症疫苗的挑战是找到作为疫苗的最佳抗原。可供选择的抗原包括过度表达的自身蛋白（例如前列腺特异性抗原），在肿瘤和健康组织中表达量不同的蛋白，和新抗原。新抗原可能是开发抗肿瘤疫苗的理想抗原，因为它们只在肿瘤中存在，而且随着肿瘤的进展不断产生。而它的缺陷在于每个患者的新抗原都不相同，这意味着疫苗也需要个体化定制，延长了疫苗到达患者手中的时间。

在最近的一项临床试验中检验了一种同时靶向20个预测的个体化肿瘤新抗原的疫苗的安全性和免疫原性。在6名接种疫苗的患者中，4名在接种疫苗25个月之后没有出现癌症复发。而两名出现复发的患者随后接受了抗PD-1疗法，并且获得完全缓解，而且这些患者中新抗原特异性T细胞群增加。这一试验不但为个体化基于疫苗的免疫疗法铺平了道路，还为验证肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂疗法联用的潜在疗效提供了证据。

T细胞免疫调节因子

有多种细胞因子（包括IL-2， IL-7， IL-15， IL=21， IL-12， GM-CSF和IFNα）可以调节T细胞的增殖、生存以及功能。它们正在临床试验中接受检验，作为单药疗法或者组合疗法的一员治疗癌症。IL-2是最早被用于作为癌症免疫疗法的细胞因子，它在治疗肾细胞癌和黑色素瘤的试验中取得过积极结果。但是IL-2对免疫系统的多重作用和严重副作用限制了它的应用可能。目前对IL-2的新一轮研究力图发现能够有倾向性地与表达在T细胞上的IL-2受体相结合的配体，比如Nektar公司的NKTR-214。这一在研疗法已经在临床试验中被检验与抗PD-1抗体nivolumab构成组合疗法治疗多种癌症。

与IL-2相关的细胞因子IL-15最近吸引了癌症免疫疗法学界的关注，因为它不具有IL-2的严重副作用，而且只会影响天然杀伤细胞，而不会影响调节性T细胞的扩增。目前对它的研究力求增加它的生物可利用性，因为它们会被肾脏迅速清除。

结语

近年来，个体化癌症免疫疗法的概念越来越得到重视。而个体化的癌症免疫疗法的前提是需要在患者确诊时，对于患者的肿瘤和免疫反应相关的关键性参数进行精确的测量。这样才能对患者进行严格分类并且用于指导下一步的疗法选择。根据肿瘤是“冷”、“热”、“排除型”还是“免疫抑制型”，一系列不同的免疫治疗策略被采用。肿瘤越“冷”，越需要结合多种疗法才能取得显著疗效。不管使用哪种免疫治疗策略，最终，将疗效最大化都需要将不同免疫疗法进行组合。

参考资料：

[1] Galon and Bruni, (2019). Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-018-0007-y