热原的科学认识与有效管理 如何预防制药行业注射剂的头号天敌

作者：张功臣

为保证用药安全，注射剂必须采用无菌生产工艺并保证最终药品完全符合药典的相关要求，因此，注射剂除应符合制剂的一般要求外，还必须符合药典规定的无热原质量要求：无热原，特别是用量一次超过5ml以上、供静脉注射或脊椎注射的注射剂，热原检查必须符合药典的有关规定。

热原是指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，通俗来讲，热原主要来源于细菌死亡后的包涵体释放物。无菌注射制剂的最终给药方式一般为静脉注射，当注射的药液中含有热原时，很可能会发生热原反应。热原反应的主要表现为输液过程中或输液后，患者出现发冷、寒战、面色苍白、四肢冰冷，继之出现高热，体温可达40℃小时以上，严重时可伴有恶心呕吐、头痛、四肢关节痛、皮肤灰白色、血压下降、昏迷休克甚至危及生命。一般注入人体的注射液中细菌内毒素含量达1μg/kg 就可致热原反应。

热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。细菌性热原是指某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。细菌内毒素可以和活的微生物连接，也可以是死的微生物裂片，或者是游离的分子。游离内毒素可以从细胞表面或从制药用水系统生成的生物膜释放出来，或者从原料进入制药用水或无菌配液系统。

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。细菌内毒素的量可用内毒素单位（EU）表示，1EU与1 IU（内毒素国际单位）相当。

内毒素属于热原的一种，但热原不全是内毒素。欧洲药典委员会曾提出："严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性"。由此可见，热原与细菌内毒素两者之间既有许多相同之处，但还是有区别的。热原与细菌内毒素均有相应的检测方法。热原检查法是将一定剂量的供试品通过静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查法是指利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查法具有较家兔热原检查法灵敏、快速、简便易行、重现性好、结果准确等优点，目前细菌内毒素检查法已广泛应用于西药和生物制品等。但同时也应该指出，细菌内毒素检查是一个复杂的酶促反应过程，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加。中药注射剂因成分复杂、影响因素多等特点，一般还是采用传统的家兔热原检查法，但是对一些具有解毒降温作用的药物，因会干扰家兔的生理活性，引起体温下降，用家兔法检测可能不准，还是应考虑用细菌内毒素检查法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，供试品在进行检测时，可使用其中任何一种方法进行试验，当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。凝胶法是指通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。光度测定法分为浊度法和显色基质法两种，浊度法是指利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法；显色基质法是指利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出显色团的多少面测定内毒素含量的方法。

在细菌内毒素检查过程中，应防止微生物和内毒素的污染。细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水；所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素，耐热器皿常用干热灭菌法（250℃ 30分钟以上）去除，也可采用其他确认不干扰细菌内毒素检查的适宜方法，若使用塑料器械（如微孔板和微量加样器配套的吸头等）应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

药品与生物制品的细菌内毒素限值一般按L=K/M进行确定，式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kgoh）表示，注射剂K=5 EU/（kgoh）；放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kgoh）；鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kgoh）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kgoh）、mg/（kgoh）或U/（kgoh）表示，人均体重按60kg计算，人均表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。

与无菌产品的微生物限度不同，注射剂产品的细菌内毒素限值并非为零，在无菌注射剂的生产过程中，需采用各种有效手段控制最终产品细菌内毒素的水平。不同注射剂产品的细菌内毒素限值各不相同，例如，盐酸哌替啶注射液的细菌内毒素限值为0.20EU/ml，灭菌注射用水的细菌内毒素限值为0.25EU/ml，而氯化钠注射液的细菌内毒素限值为0.50EU/ml。细菌内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量要远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准要严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度。

细菌内毒素的性质主要包括如下几个方面：（a）细菌内毒素能溶于水，以水为溶剂的注射剂要采取措施除去细菌内毒素；（b）细菌内毒素体积小，约为1~5 nm之间，故可通过超滤膜或反渗透膜进行去除；活性炭对细菌内毒素有吸附作用，可以滤除细菌内毒素；（c）内毒素本身不挥发，但因具有水溶性，蒸馏时可随着水蒸气雾滴进入蒸馏水中；（d）细菌内毒素非常耐热，60℃加热1小时不受影响，100℃时大多数也不会发生热解，180℃ 3~4小时，250℃ 30~45分钟或650℃ 1分钟才可彻底破坏细菌内毒素，一般注射剂的灭菌条件，不能彻底破坏细菌内毒素；（e）细菌内毒素能被强酸、强碱、强氧化剂、超声波等破坏，粒子交换树脂能吸附细菌内毒素。

热原的处理方法主要包括灭活法与分离法两大类。灭活法主要包括干热灭菌法、酸处理、碱处理、氧化剂处理和烷化剂处理等，例如采用干热灭菌柜在250℃ 30min以上可以焚化细菌内毒素，或在线清洗工作站采用2%碱液循环清洗去除制药配液系统中的细菌内毒素等；分离法主要包含吸附法、膜分离法和蒸馏法等，例如，制备纯化水时控制细菌内毒素的方法主要包括活性炭吸附、超滤、反渗透与蒸馏等工艺，而在注射用水的制备过程中，吸附法、膜分离法和蒸馏法现已被成熟应用于去除原水中的细菌内毒素。

（1）吸附法

吸附法可以有效地去除热原，常用的吸附材料有活性炭、阴离子交换树脂、硫酸钡、石棉等。美国药典收载了活性炭、大分子阴离子交换树脂去除热原的方法，在纯化水制备工艺中，活性炭吸附是去除热原最常采用的方法，它通常要与薄膜过滤器联合使用，以防止活性炭进入下道工序；若原水中细菌内毒素污染程度较低时，使用大分子阴离子交换树脂去除热原的方法比较适用。

（2）膜分离法

超滤、微孔膜过滤和反渗透均属于膜分离技术，它们之间各有分工，但并不存在明显的界限，超滤膜孔径大的一端与微孔滤膜相重叠，孔径小的一端与反渗透相重叠。美国药典与日本药典将反渗透与超滤结合的方法作为注射用水的法定生产方法，同时，欧盟药典已通过决议允许膜过滤法应用于注射用水的制备，并将于2017年4月开始正式实施，意味着膜分离技术在去除热原方面的成熟。反渗透、超滤、微孔膜过滤有其相似之处，它们都是在压差的驱动下，利用膜的特定性能将水中离子、分子、胶体、热原、微生物等微粒分离，但它们分离的机理及对象有所不同。

反渗透膜的孔径最小，按其阻滞污染物（包括热原）的分子量大小计，一般在100～200之间。由于热原的分子量在50000以上，其直径大小一般在1～50μm之间，因此能被有效去除。反渗透膜只允许1nm以下的无机离子为其主要分离对象，故有良好的除盐作用，而超滤、微孔膜过滤并无除盐性能。

微孔膜过滤有某种去除热原的功效，它利用筛分、静电吸附和架桥原理拦截直径比较大的那一部分热原物质，应当指出，这种去除是很不完全的，直径比较小的热原物质会通过0.22μm的微孔滤膜，微小的热原可以透过0.025μm的滤膜，最小的热原体甚至可以穿透所有的微孔滤膜。由于热原分子量越大，致热作用就越强，因此利用微孔滤膜进行除菌过滤时，客观上可能会起到某些截留热原的积极作用，但它不能作为去除热原的可靠方法而单独使用，因此，企业需要在生产过程中控制细菌内毒素指标符合药典的限定要求。

从非匀质超滤膜电子扫描图可以看到，超滤的过滤介质具有类似筛网的结构，而过滤仅发生在滤膜的表面。与反渗透不同，超滤主要靠机械法分离内毒素，超滤过程同时发生三种情况：分离物被吸附滞留、被阻塞或被截留在膜的表面并实现筛分。超滤膜的孔径大致在0.005～1μm之间，细菌的大小在0.2～800μm之间，因此用超滤膜可去除细菌。然而，对人体致热原效应的热原分子量为80万～100万，自然存在的热原群体是一个混合体，小的一端仅为1～3μm，因此，用以截留热原的超滤膜的分子量级需达到1万～8万方能有效去除热原。超滤与微孔过滤的方式不同，微孔膜过滤为静态过滤，将溶液搅拌，以消除浓差极化层，超滤则为动态过滤，滤膜表面不断受到流动溶液的冲刷，故不易形成浓差极化层。

（3）蒸馏法

由于细菌内毒素不具有挥发性，蒸馏法一直是制备注射用水最有效、最安全与最普及的方法，蒸馏是采用气液相变法和物理分离法的原理对原料水进行化学和微生物纯化的工艺过程，通过蒸馏法至少能减少原料水中99.99%的内毒素含量。

参考文献：

1. 国家药品食品监督管理局，药品生产质量管理规范（2010年修订），2010

2. 国家药典委员会，中华人民共和国药典2015年版，中国医药科技出版社，2015

3. European Pharmacopoeia 9th，2016

4. U.S. Pharmacopeia National Formulary 41，2017

5. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations fourty-sixth Report，Annex 2：WHO Good Manufacturing Practices：Water for Pharmaceutical Use，2012

6. FDA，Guide to Inspections of High Purity Water Systems，1993

7. 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心，中国医药科技出版社，GMP实施指南，2010

8. 化学工业出版社，制药用水系统，2016

9. 良好自动化生产实践指南（第五版）