Science封面：免疫疗法登上肿瘤学主流舞台，Carl June综述畅谈CAR-T发展现状

顶级学术期刊《Science》以“The Cancer Immunotherapy Revolution”为主题，以封面及特刊的形式聚焦肿瘤免疫治疗。其中特刊文章包括CAR-T细胞治疗先驱Carl June教授的一篇综述。

过继性T细胞转移(adoptive T-cell transfer，ACT)作为输血医学的一个新领域，涉及淋巴细胞的回输以介导抗肿瘤、抗病毒或抗炎作用。目前，该领域已经从临床前模型中的一种有前景的免疫肿瘤学迅速发展为批准上市的嵌合抗原受体(CAR)T细胞产品，用于治疗白血病和淋巴瘤。Carl June博士的这篇综述描述了CAR-T进入主流肿瘤学面临的机遇和挑战，其中重点关注过去几年出现的挑战。

通过将复杂的离体培养和细胞工程方法应用于过继性T细胞转移(ACT)，研究人员已经实现了其治疗难治性癌症的持久临床反应，揭示了ACT的能力和潜力。在引人注目的数据基础上，美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了两款以CD19为靶点的CAR-T细胞产品，用于治疗难治性前B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。该综述集中探讨了：

通用CAR-T细胞的前景

CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用

CAR-T细胞疗法在应用和商业化方面出现的差异

针对癌症治疗开发的三种形式ACT，包括：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)T细胞和CAR-T细胞。其中TIL在多个临床试验中，已经显示出诱导转移性黑素瘤患者的持久完全反应。数据显示，TIL治疗的基本原理已经证实，其能够靶向黑色素瘤中的新抗原。类似地，基因转移技术已被用于外周血T淋巴细胞以产生具有TCR或CAR的细胞。很多制药和生物技术公司正在将这些不同形式的ACT进行商业化。

基因工程T细胞

TCR与CAR-T细胞免疫治疗

TCRs利用α和β肽链构成的异元二聚体(heterodimer)来识别由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)呈现在细胞表面的多肽片段。临床中使用的第一种TCR -T细胞癌症免疫疗法是针对的适应症是转移性黑素瘤，使用TCR结合来自黑素细胞分化抗原的人淋巴细胞抗原A2(HLA-A2)肽。

随后，研究人员开发了针对MART-1(由T细胞1识别的黑素瘤抗原)表位的更高亲和力的TCR，目的是通过降低MART-1表达来增强其对恶性细胞的识别。尽管研究机构证实了改善的响应率，但不可避免的是其对正常黑素细胞的杀伤，超过一半的患者在治疗过程中经历了on-target/off-tumor毒性。同时，进一步突出了靶向癌睾丸抗原MAGE-A3的TCRs相关的致死性神经毒性和心脏毒性的挑战。

然而，用表达对HLA-A2限制性肽特异性的亲和力增强的TCR的T细胞靶向癌睾丸抗原NY-ESO-1产生临床效力的证据，并没有观察到显着的毒性。工程化的NY-ESO-1 T细胞正在进行晚期临床试验评估(NCT01343043，clinicaltrials.gov)，或许针对特定肿瘤新抗原特异性的TCR开发的TCR-T细胞治疗比靶向肿瘤特异共有抗原更安全(还没有经过临床测试)。

而相比较来说，CAR克服了工程化TCR的某些局限性，例如对MHC表达，MHC特性和共刺激的需要。由Kuwana和Eshhar领导的小组首次表明了，这些类型的合成受体分子能够通过T细胞识别MHC非依赖性靶标。来自MHC限制的CAR识别的独立性赋予了CAR-T细胞具有基本的抗肿瘤优势，因为癌症免疫逃逸的主要机制是肿瘤细胞中与MHC相关的抗原呈现丢失。而当前CAR-T细胞的一个局限性是它们需要靶向肿瘤细胞表面上的抗原。

B细胞恶性肿瘤

CAR-T的意外成功

事实上，使用第一代CAR设计的T细胞疗法在针对多种癌症患者治疗的初步临床试验结果是令人失望的。但是，在2011年，靶向CD19和编码共刺激区的第二代CAR-T细胞成为癌症工程化T细胞治疗的主要范式。几个主要的特征使CD19成为了近乎理想的治疗靶点。它在B细胞恶性肿瘤中显示出频繁且高水平的表达，是人类正常B细胞发育所必需的，且其不在B细胞谱系之外表达。

大多数复发性白血病患者在CD19特异性CAR T细胞治疗后达到完全缓解。但出现了对这种治疗的两种形式的抵抗。在急性白血病患者中，CAR-T细胞靶向的CD19上抗原表位的缺失似乎是肿瘤逃逸的主要机制。这类似于由于获得的抗原呈递缺陷或基于TCR T细胞的疗法观察到的抗原损失引起的抗原逃逸机制。在针对年轻成人和小儿急性白血病患者的国际试验中，CD19阴性复发的频率为28％。尚未报道CD19缺失是慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的一种耐药形式，CLL的耐药性可能是由于输注后CAR-T细胞不能增殖。表2列出了CAR-T细胞疗法在临床转化治疗中需要克服的几个重要挑战。

更广泛的CAR-T应用

CAR-T技术现在已被证明具有超越CD19的更广泛的应用，其中针对BCMA和CD22的CAR-T细胞的早期临床试验分别报道了在多发性骨髓瘤和急性成淋巴细胞性白血病中类似的有效的抗肿瘤活性。然而，BCMA和CD22与CD19一样，高度局限于B细胞谱系。

与此同时，研究人员试图通过靶向肿瘤相关抗原的方法来治疗实体瘤也取得了一些进展。

其中靶向ERBB2/HER2的CAR T细胞治疗在第一例患者中导致了致命的毒性。通过使用具有基于赫赛汀(Herceptin，曲妥珠单抗)和CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域的高亲和力scFV的第三代CAR，发现该毒性明显是由识别和杀死在低密度表达ERBB2的阳性细胞肺上皮细胞，引发肺功能衰竭和大量细胞因子释放。较低剂量的具有比基于赫赛汀的CAR更低亲和力的scFv的CAR T细胞在肉瘤患者中已被证实是安全的，但仅具有适度的临床活性。

另外，靶向碳酸酐酶IX(CAIX)抗原的第一代CAR-T细胞在肾细胞癌中的I期临床试验中也遇到了意想不到的肝毒性，这是由于CAIX抗原在正常胆道上皮上的低密度表达所导致的，但在临床前研究并没有发现。在靶向CEACAM5的CAR-T细胞疗法试验中，延迟的呼吸毒性与T细胞峰值扩展一致，这也表明用这种癌症相关抗原潜在的on-target/off-tumor毒性。

针对与实体瘤相关的其他共享抗原(包括间皮素、癌胚抗原和GD2神经节苷脂)的CAR的临床试验尚未报告明显的毒性；然而，这些试验中观察到的抗肿瘤活性也很弱。而具有增强的抗肿瘤活性的GD2特异性CAR-T细胞会在临床前模型中诱导致命的神经毒性。

另外，靶向白细胞介素(IL)-13受体α2的CAR-T细胞局部区域注射治疗多形性成胶质细胞瘤，显示出了抗肿瘤活性，没有出现诸如静脉注射引起的明显毒性。这表明，针对某些抗原的CAR-T细胞的直接瘤内注射可增强治疗性指数。靶向肿瘤特异性抗原表皮生长因子受体(EGFRvIII)的CAR-T细胞疗法，已经证明了安全性，但是在一些接受治疗的患者中观察到了肿瘤内的EGFRvIII抗原丢失，这表明有效的治疗方法需要靶向多种抗原以防止抗原逃逸。

另外，不容忽视的是，肿瘤微环境为ACT的成功应用提供了额外的障碍，特别是在实体瘤中。包括免疫检查点(例如PD-L1，程序性死亡1受体的配体的表达)、肿瘤代谢环境的改变(例如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶)、调节性T细胞以及抑制性骨髓细胞。这些都会在细胞治疗的过程中，表现出适应性抗性。

目前，PD-1 / PD-L1单抗与CD19特异性CAR-T细胞疗法组合的临床试验正在进行中(例如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405；clinicaltrials.gov)。除了与其检查点抑制剂的组合以外，研究人员还在开发用于破坏这些抑制途径的替代方法，例如开关受体或基因编辑。

CAR-T细胞疗法的毒性

接受ACT治疗后，T细胞活化预期会出现一定程度的免疫刺激和炎症反应。目前，CD19特异性、BCMA特异性和CD22特异性CAR-T细胞在临床应用中均观察到了严重的细胞因子释放综合征(CRS)。这种综合征可能比通常用TIL和TCR治疗所观察到的流感样综合征更严重。且CAR-T细胞相关CRS的严重性与肿瘤负荷相关。在最严重的形式中，CRS与噬血细胞淋巴组织细胞增多症和巨噬细胞活化综合征具有许多共同特征。

此外，在CD19和BCMA特异性CAR-T细胞的不同临床研究中也报道了轻微至危及生命的意外神经系统并发症。其中CD19特异性CAR-T细胞相关否认神经毒性大部分可逆，但目前还不知道由CAR-T细胞治疗引起的脑水肿是CRS的极端表现还是存在单独的作用机制。为支持后者，有证据表明内皮损伤，可能与炎症细胞因子有关，导致神经毒性的发生。事实上，研究人员对于T细胞免疫治疗介导的CRS和脑水肿的潜在机制知之甚少，部分原因是由于该领域缺乏信息动物模型来研究这些重要的毒性。

通用CAR-T细胞

尽管ACT是从异基因骨髓移植演变而来，但由于MHC施加的内在障碍，ACT策略还是主要集中于自体T细胞。理论上来说，如果可以消除MHC障碍，就能够做到同种异体T细胞治疗，相比较于自体T细胞治疗，具有显着优势。而且源自健康供体的通用CAR-T细胞有可能克服许多与癌症治疗相关的免疫缺陷。此外，通用CAR-T细胞疗法的使用可能为简化工程细胞制造提供机会，甚至能够获得更快速和更便宜的“现货(off the shelf)”ACT产品。

第一项报道使用基因编辑技术产生无功能内源性TCR的通用CAR-T细胞的研究是由Torikai等人领导的。最近，一项基于TALEN工程化改造的细胞试验在两名患者身上进行了测试，结果证明了现成的CD19特异性通用CAR-T细胞疗法的可行性。但基因通用CAR-T细胞的植入在两个受试者中都受到限制，从而限制了该方法在试点研究中的有效性。

重要的是，在所有MHC I类等位基因上错配的受试者1经历了移植物抗宿主病。尽管由阿仑单抗引起了严重免疫抑制，但自然杀伤(NK)细胞对MHC I类缺陷细胞的识别也可能具有一定的局限性。防止通用CAR-T细胞的NK溶解的一个有吸引力的策略是插入HLA-E并删除HLA-A，-B和-C，以阻止了宿主T细胞杀死通用CAR-T细胞。鉴于该领域的快速发展，通用CAR-T细胞很可能会被广泛使用。然而，存在的主要问题是这种方法是否足够有效地用作独立疗法，或者作为最终治疗的辅助疗法，例如干细胞移植或自体CAR-T细胞治疗。

CAR-T细胞治疗的商业化

现在全球有超过250个正在进行的CAR-T细胞临床试验。值得注意的是，这些试验开展的地理位置存在差异，其中中国和美国都存在转化研究的热点，而相比较来说，欧洲、日本和南半球开展的临床试验要少得多。当然，地理差异的原因可能很复杂，这与采纳和投资新疗法的意愿，卫生部门的不同监管政策以及社会差异息息相关。

血液恶性肿瘤患者，特别是CLL和多发性骨髓瘤患者接受的非固有治疗带来的经济负担也面临挑战。作为美国最常见的白血病形式，2000年约有100000名CLL患者，而且由于接受的治疗方式只能改善生存状况，并不能达到治愈的目的。因此给患者和经济带来了巨大的经济负担，据估计，每名患者的终生治疗费用为604000美元，到2025年，仅美国的CLL管理总费用估计每年就要超过50亿美元。

而相比较于传统疗法，CAR-T细胞治疗可能更具成本效益。但高度个性化的T细胞治疗需要定制的制造工艺，使得成本较高。但随着工艺的成熟，预计成本会有所下降。

未来的机会和应用

从几个角度来看，针对白血病和淋巴瘤的CAR-T细胞疗法的出现是值得注意的。也许最重要的是，CAR-T是获得美国FDA批准的第一种商业化基因转移疗法。

由于CRS和神经毒性的风险，CAR-T细胞在批准前通过了风险评估，并制定了不良反应应对策略。与此同时，FDA要求医生完成不良反应管理的培训。目前，开发基于细胞的治疗方法的最大挑战之一是缺乏临床前模型来评估这些复杂的疗法在进行人体研究之前的安全性和有效性，或者是对早期临床研究中发现的安全问题的反应。此外，其在治疗实体瘤方面仍然存在许多障碍。

值得一提的是，工程化T细胞、基因编辑和细胞制造领域的持续进展有可能将基于T细胞的疗法扩大到其他细胞类型，如诱导多能干细胞、造血干细胞和NK细胞，而且针对的适应症并不仅仅是癌症，亦或是传染性疾病、器官移植术和自身免疫性疾病等。