PNAS：周琪院士组首次发现大鼠干细胞多能性调控新规律

早在2009年，中科院动物研究所周琪课题组与当时还在NIBS的高绍荣课题组就分别独立发现了小鼠iPSCs具有通过四倍体补偿获得健康动物的能力，使得小鼠ESCs和iPSCs成为仅有的两种通过四倍体补偿这个最严格标准的多能性干细胞。然而其它物种的干细胞是否具有最高等级的多能性仍然未知。10月23日，中科院动物所周琪院士课题组在PNAS杂志在线发表了题为“Rat embryonic stem cells produce fertile offspring through tetraploid complementation”的研究论文，首次报道了在小鼠之外，大鼠胚胎干细胞也具有通过四倍体补偿实验产生健康个体的能力，证实最高等级的多能性可以在不同物种间的干细胞上建立，并发现最高多能性维持的新规律，为研究多能性的物种进化差异和调控机制提供了新基础。

论文解读：

多能性干细胞（PSCs）包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能性干细胞（iPSCs）具有分化多能性，能够分化形成各种类型和功能的体细胞，因而在发育生物学研究和再生医学中具有重要的应用价值。

多能性干细胞具有自我更新和分化成三胚层细胞的能力，在分子水平上与内细胞团（ICM）具有类似的表达模式，包括特异高表达多能性维持相关基因，如Oct4、Sox2、Nanog等。分化能力可以从五个方面进行评价(Jaenisch and Young, 2008)：1) 体外分化潜能，即向特定细胞类型分化并表达细胞类型特异标记基因能力；2) 畸胎瘤形成能力：通过检测畸胎瘤中各胚层细胞类型判断其分化能力；3)嵌合体形成能力，注入二倍体囊胚后，形成正常组织器官的能力；4) 种系嵌合能力 (Germline transmission, GLT)，指在注入二倍体囊胚后形成生殖细胞能力；5) 四倍体补偿实验 (Tetraploid complementation)，将多能性干细胞注入四倍体的囊胚，检测其发育成为完整个体的能力(Nagy et al., 1990)，是目前最为严格的多能性检测标准。

2009年，中国科学院动物研究所周琪课题组(Zhao et al., 2009)与高绍荣课题组(Kang et al., 2009)独立发现了小鼠iPSCs具有通过四倍体补偿获得健康动物的能力。使得小鼠ESCs和iPSCs成为仅有的两种通过四倍体补偿这个最严格标准的多能性干细胞。其它物种的干细胞是否具有最高等级的多能性仍然未知。

在这项研究中，研究人员首先建立了大鼠这一重要模式生物的四倍体补偿技术系统（下图），为干细胞多能性的研究和评估提供了技术平台。进而系统评估了不同来源的干细胞在不同代次的发育能力，发现t2i培养条件（1 μM MEK inhibitor and 1 μM GSK3 inhibitor）建立的低代次大鼠ESCs具有很好的多能性，能够发育成健康个体，但是这一能力随着细胞培养传代迅速丧失。

进一步研究揭示随着大鼠ESCs在体外的培养，细胞基因组甲基化水平迅速降低，基因组印记被擦除，导致印记丢失从而丧失了发育能力。对于小鼠ESCs来说，虽然其也会发生甲基化水平降低和印记丢失，但是去甲基化速率显著慢于大鼠ESCs。这提示虽然最高多能性在不同物种的干细胞间是保守的，但是其调控模式可能存在物种特异性。这些研究发现对从包括人在内的物种中建立具有最高多能性的干细胞提供了新思路，也为进一步了解不同物种干细胞多能性的建立和调控提供了重要基础。

值得注意的是，在该文章revised 的过程中，Nature杂志在今年8月份同期发表两篇文章提出小鼠ESCs 在2i 培养体系下也存在四倍体补偿能力丧失的情况，而导致该问题的原因正是全基因包括印记控制区的甲基化丢失，但丢失速度相对大鼠ESC较为缓慢(Choi et al., 2017; Yagi et al., 2017)。

大鼠胚胎干细胞在改造的2i培养体系下，早代次能够通过四倍体补偿方式得到健康动物，但高代次细胞则由于全基因组甲基化的丢失则丧失了该能力。

小鼠多能性干细胞在多能性研究中处于处于较高的水平，本研究则使得大鼠多能性干细胞跨过了四倍体补偿这个台阶。而人和其它非人灵长类干细胞的研究由于伦理和水平的限制，仍有很大差距。

总的来说，这项工作首次报道了在小鼠之外，大鼠胚胎干细胞同样具有通过四倍体补偿实验产生健康个体的能力，证实最高等级的多能性可以在不同物种间的干细胞上建立，并发现最高多能性维持的新规律，为研究多能性的物种进化差异和调控机制提供了新基础。

据悉，中国科学院动物研究所的李天达博士、冯桂海博士、以及博士研究生李宇飞和汪妹为本文的共同第一作者，周琪院士为通讯作者。该项研究得到国家重点基础研究发展计划、国家自然科学基金和科学院干细胞与再生医学战略先导专项的支持。

参考文献：

Choi, J., Huebner, A.J., Clement, K., Walsh, R.M., Savol, A., Lin, K., Gu, H., Di Stefano, B., Brumbaugh, J., Kim, S.Y., et al. (2017). Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature 548, 219-223.

Jaenisch, R., and Young, R. (2008). Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell 132, 567-582.

Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., and Gao, S. (2009). iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell stem cell 5, 135-138.

Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E.M., Prideaux, V.R., Ivanyi, E., Markkula, M., and Rossant, J. (1990). Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development 110, 815-821.

Yagi, M., Kishigami, S., Tanaka, A., Semi, K., Mizutani, E., Wakayama, S., Wakayama, T., Yamamoto, T., and Yamada, Y. (2017). Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature 548, 224-227.

Zhao, X.Y., Li, W., Lv, Z., Liu, L., Tong, M., Hai, T., Hao, J., Guo, C.L., Ma, Q.W., Wang, L., et al. (2009). iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 461, 86-90.

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