基因疗法能够为传统治疗手段无法触及的疾病提供治疗选择！自2016年以来，欧盟EMA和美国FDA已经批准了6款基因疗法产品，其中包括治疗B细胞血癌的两款CAR-T细胞疗法，和四款治疗严重单基因遗传病的基因疗法。

今年，美国FDA和欧盟EMA分别批准了诺华（Novartis）治疗脊髓性肌肉萎缩（SMA）的Zolgensma和bluebird bio治疗β地中海贫血的Zynteglo。如今，超过800个细胞和基因疗法项目处于临床开发阶段，可以预见更多细胞和基因疗法将获批上市。近日，著名医学期刊《新英格兰医学杂志》（NEJM）上的一篇综述对这一领域的现状和未来进行了盘点，药明康德内容团队今天将与读者们分享这一综述的精彩内容。

基因疗法的基本原理

治疗遗传病的基因疗法的目标是：持续表达治疗性基因或转基因，维持足够水平的基因表达，从而在缓解或治愈疾病症状的同时，将副作用降至最小。目前有两种基本策略：一是使用整合性载体，将转基因导入干细胞或祖细胞中，让转基因可以传递到每个后代细胞中；二是使用非整合性载体，将转基因递送到长期存活的细胞中（它们可能不再分裂或者分裂非常缓慢），确保转基因能够在细胞中长期表达。对干细胞的转导通常离体（ex vivo）进行，需要使用整合型载体，而向长期存活的细胞中递送基因疗法通常使用体内（in vivo）基因递送手段。

使用离体转导策略，研究人员需要从患者身上获取细胞，导入治疗性基因，然后利用与造血干细胞移植类似的方法将这些改造过的细胞输回患者体内。这一策略需要递送基因的载体、被递送的基因片段，以及一个技术复杂的设施来处理这些细胞。与之相比，体内基因递送系统的使用跟其它药品类似，包含转基因的载体通常被冷冻保存，它可以被药剂师解冻和准备好，通常门诊手术就可以完成给药。

使用基因疗法治疗遗传病需要的不只是发现致病基因。转基因需要被递送到与生理学相关的靶点组织或细胞中，它们需要稳定表达，而且必须不会影响这些细胞的正常功能。

安全性考量

▲基因疗法的理论风险和观察到的临床风险（数据来源：参考资料[1]，药明康德内容团队制图）

在获得与基因疗法相关的临床数据之前，研究人员已经列出了它们潜在的理论风险。而临床数据的产生重新为这些风险的重要性进行了排序。现在我们知道，整合型载体（例如逆转录病毒载体）的主要风险是插入突变（insertional mutagenesis）——它们可能通过整合到细胞的DNA中，扰乱DNA上原有基因的功能。对于体内递送基因疗法的载体，主要风险来自对载体的免疫反应。

对于插入突变，降低这一风险的主要方法是设计更安全的病毒载体（例如慢病毒载体）。而免疫反应的风险可以通过使用辅助性免疫调节药物来控制。前期研究的失败和意外不良事件的经验对这些优化措施的开发作出了重要的指导。

离体基因疗法

▲离体基因疗法示意图（图片来源：Boston Children's Hospital官网）

治疗严重联合免疫缺陷（SCID）——我们学到了什么？

在2016年，基于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的离体基因疗法达到了一个里程碑。EMA批准Orchard Therapeutis公司的Strimvelis上市，治疗腺苷脱氨酶（ADA）缺失导致的严重联合免疫缺陷。这一疗法使用γ-逆转录病毒载体，将正常的ADA基因导入患者自身的HSPCs中，然后输回患者体内。

20多年前，第一项使用γ-逆转录病毒载体治疗ADA缺失性严重联合免疫缺陷的研究没有获得成功，因为输回患者体内后，定植在体内的HSPCs数量不足。近10年来的研究发现，想要维持长久的ADA蛋白表达，需要在移植HSPCs之前，使用低剂量的白消安（busulfan）来杀死骨髓中原有的骨髓细胞，这可以为基因工程改造过的HSPCs留出空间，提高它们的定植水平。不幸的是，消除骨髓细胞的化疗手段具有毒性，可能提高继发性肿瘤产生的风险，或者导致骨髓衰竭。目前，研究人员正在探索其它消除骨髓细胞的方法，其中包括基于抗体的消除手段。

早期临床试验发现的另一个问题是γ-逆转录病毒载体在某些患者中可能引起T细胞淋巴癌，导致他们需要接受高剂量化疗和骨髓移植，这一严重副作用促使研究人员寻找更安全的病毒载体。

慢病毒整合进人类基因组的模式比γ-逆转录病毒载体更安全。虽然，生产临床级别的慢病毒载体仍然是一个挑战，但是基于慢病毒的离体基因疗法策略目前在多项临床试验中治疗免疫缺陷、代谢疾病和遗传性血液病。

治疗地中海贫血和镰状细胞贫血症

治疗β-地中海贫血和镰状细胞贫血症的基因疗法在经过研究人员30多年的努力后终于见到了曙光。今年EMA批准了bluebird bio开发的Zynteglo，治疗12岁以上的输血依赖型β-地中海贫血患者（非β0/ β0基因型）。研究表明，基因疗法的临床效力与基因转导效率、转导细胞中的病毒拷贝数目、和基因工程改造过的HSPCs的输入剂量成正比。目前，有四项基因疗法临床试验正在进行中，使用不同载体靶向不同基因，治疗镰状细胞贫血症。

体内基因疗法

▲使用AAV载体递送基因疗法的示意图（图片来源：Public Domain）

体内基因转导研究将载体直接注射到患者体内，它们被用来治疗多种单基因疾病。AAV载体是大多数研究中使用的载体，它没有致病性，而且不会引起强烈的免疫反应。AAV载体局限性之一是当转基因序列大于5 kb后，转基因包装进载体的效率迅速下降。早先的临床研究发现人体的免疫反应是阻碍全身性AAV基因疗法疗效的主要障碍。因为很多人已经受到过野生型AAV的感染，因此体内不但具有靶向AAV的循环抗体，还有衣壳特异性记忆T细胞。开发绕过已有抗体的中和效应和控制细胞性免疫反应的方法是推广AAV临床应用的关键。

第一款获得批准的AAV基因疗法是uniQure公司开发的Glybera。它在2012年获得EMA批准，治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症。虽然由于市场需求很低，这款基因疗法在2017年退市，然而它的批准表明，基于AAV的基因疗法能够满足监管要求，因此激发了其它AAV基因疗法的开发。

治疗视力丧失

在2017年12月，FDA批准了Spark Therapeutics公司开发的Luxturna，用于治疗由于RPE65基因上的突变导致的罕见失明症。RPE65基因编码的蛋白酶对视觉循环非常关键。如果不接受治疗，这一疾病在多数患者中会导致完全失明。视网膜是非常适于基因疗法的靶点组织，因为它能够耐受引入的外来抗原而不会产生炎症性免疫反应，而且治疗眼科疾病需要的载体数量相对较少。AAV载体可以在门诊手术中被注射到视网膜下。Luxturna的获批激发了使用类似策略治疗其它类型先天性失明疾病的研究。目前有多项临床试验治疗各种遗传性视网膜营养不良。

全身性基因疗法递送，治疗血友病和免疫反应

通过静脉输液输入AAV载体可以靶向肝脏和其它器官递送基因疗法。早期的临床试验试图使用血管内给药的方式输入AAV基因疗法，治疗严重B型血友病患者。这一临床试验的结果发现了两大免疫学障碍：20-40%患者体内已经存在靶向AAV的抗体，它们会中和载体，降低疗效；人体在接受载体输入4-12周之后，会产生针对AAV衣壳的延迟免疫反应。这一免疫反应会攻击已经被转导的细胞，导致疗效消失。

这两大问题的原因都是人体曾经受到过野生型AAV的感染，导致体内存在靶向抗体和记忆T细胞。

针对体内已有抗体的短期解决办法是将携带已有抗体的患者排除在治疗范围之外，显然我们需要更好的方法。目前克服这一障碍的策略包括：使用不常见的AAV亚型，人工生成嵌合型AAV或修改AAV衣壳上引发免疫反应的蛋白抗原。

▲改进AAV载体衣壳蛋白的策略（图片来源：参考资料[2]）

延迟免疫反应的临床表现为转氨酶水平升高，后续研究表明外周血中的单核细胞在识别与AAV衣壳相关的多肽片段后会分泌干扰素γ。这会导致转基因表达的凝血因子IX蛋白水平逐渐下降，直至完全消失。

这一发现意味着如果对免疫系统暂时进行药理学抑制，可能帮助维持基因疗法的疗效，因为衣壳蛋白相关多肽片段只会在体内暂时出现。这一假说在后续临床试验中得到验证，参加临床试验的患者在出现转氨酶升高或凝血因子IX水平下降时，接受糖皮质激素的治疗。这导致了基因疗法疗效的显著增强。

降低免疫反应的另一个方法是使用具有超出野生型活性的凝血因子IX变体。这可以让患者在接受更少剂量基因疗法（剂量是先前疗法的四分之一）的情况下，维持更高的平均因子IX活性水平。因为免疫反应的强度与输入AAV载体的剂量相关，减少AAV基因疗法的剂量在后续临床试验中引发免疫反应的频率也有所下降。

在治疗A型血友病方面，因为编码凝血因子VIII的基因很大，所以将具有正常功能的转基因装入AAV载体是一个需要克服的挑战。目前临床试验中使用的基因疗法表达的是一款“精简版”因子VIII。BioMarin公司开发的Valoctocogene roxaparvovec已经在3期临床试验中获得积极结果，并且在长达3年的随访时间中显著降低了患者的年出血率和因子VIII使用率。该公司计划在今年第四季度递交监管申请。

治疗脊髓性肌肉萎缩

全身性AAV基因疗法的另一个成功案例是诺华公司（Novartis）今年获批治疗脊髓性肌肉萎缩（SMA）的Zolgensma。SMA是由于编码运动神经元生存蛋白的SMN1基因出现突变而导致的罕见遗传病。根据发病的时间和严重程度，它可以分为四种亚型。1型SMA是导致婴儿死亡的最常见遗传因素，患者死亡或需要持续呼吸辅助的中位年龄为10.5个月。Zolgensma的临床试验已经扩展到超过100名婴幼儿。试验结果与最初的临床结果一致。

基因疗法的机遇和挑战

在监管方面的两个最新动向将支持基因疗法作为治疗模式的进一步成熟。第一个动向是美国国立卫生研究院（NIH）主任Francis Collins博士和前FDA局长Scott Gottlieb博士宣布，FDA将完全负责对基因疗法进行审评。此前，基因疗法需要经过NIH重组DNA咨询委员会和FDA的双重审评。这一变化有助于简化基因疗法的审评程序。

另一个动向是FDA组织和先进疗法办公室（Office of Tissue and Advanced Therapies）在2018年发布了6个新的指导文件，根据这一领域的经验和共识，对使用基因疗法治疗多种疾病在临床前、临床期研究和生产方面提出了标准化的指导和建议。

基因疗法的成本是可能阻碍它获得广泛推广的一个重要因素。以前的医疗保险体系的设计是针对需要长期服用的药物类型，对于所有细胞和基因疗法来说，如何将这种“一次性”治疗，但是可能带来长期疗效的治疗模式融入医疗保险体系是一个重要的挑战。

大多数人同意，如果疗效相当，一次治疗的模式要优于必须重复使用的药物。因此，一次性疗法带来的长远利益将证明高成本疗法的价值。血友病就是一个很好的例子，目前，治疗血友病的标准疗法是凝血因子替代疗法，这种疗法不但需要患者每周接受3-4次输液治疗，而且每年每位患者的治疗成本高达40万美元以上。治疗血友病的新基因疗法长远来看，可能为医疗保健系统节省资源。

然而，对于以前没有任何治疗方法的疾病来说，如何支付创新疗法的费用仍然需要被解决。目前药物开发公司也在对多种付费模式进行探索，包括根据治疗效果付费，以及在治疗效果得到维持的情况下分期付费。

对于离体基因疗法来说，未来的目标是：

1、优化慢病毒载体的设计，进一步提高安全性和对转基因的控制。

2、有效地大规模生产载体并对它们进行分析评估。

3、开发毒性更小的前期处理疗法，在提高基因工程改造后的干细胞定植水平的同时，减少并发症的产生。

对于使用AAV载体的体内基因疗法来说，下一个十年里专注的问题是：

1、进一步澄清和控制人体对病毒载体的免疫反应。

2、改进AAV载体设计，在改善靶向递送基因疗法能力的同时，降低需要的疗法剂量，提高体内疗效。

总体来看，基因疗法领域的进步已经为很多以前无法治愈的疾病提供了令人兴奋的新治疗机会。我们期待在医药产业不同成员的协作努力之下，这一新的治疗模式能够克服现有的挑战，发挥它全部的治疗潜力！

参考资料：

[1] High and Roncarolo, (2019). Gene Therapy. The New England Journal of Medicine, DOI: 10.1056/NEJMra1706910.

[2] Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9