LAV与经纬中国共同押注，定点偶联技术强在何处？

近日，浙江新码生物完成超4亿元的A轮融资，本轮由礼来亚洲基金（LAV）和经纬中国共同领投，国投招商、三花弘道等跟投。融资将用于支持ARX788的临床开发及商业化准备、产品线拓展和自主创新技术平台建设。ARX788为一款靶向HER2的ADC药物，关键技术为非天然氨基酸定点偶联技术。

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随机偶联

在ADC Linker的设计中，偶联方式主要包括随机偶联和定点偶联，其中，随机偶联可分为基于赖氨酸的偶联和基于半胱氨酸的偶联。就二者而言，半胱氨酸随机偶联优于赖氨酸随机偶联，新一代的ADC药物更多采用半胱氨酸的随机偶联。原因在于前者的偶联方式较后者异质性更小，附着部位更容易预测，这与两种随机偶联方式偶联位点数量息息相关。

赖氨酸随机偶联：在Payload与单抗的结合中，早期常利用亲电基团，如马来酰亚胺或者N-羟基琥珀酰亚胺和暴露赖氨酸的氨基反应（-NH2）。但是，由于每个抗体上存在80-100个赖氨酸的氨基，因此反应呈随机性，导致每个抗体上的毒素数量和位点并不一致，生产出来的ADC产品十分不均一，最终影响ADC药物的PK/PD等。许多ADC药物均使用赖氨酸随机偶联，包括T-DM1、Mylotarg、Besponsa等。

基于赖氨酸的随机偶联

半胱氨酸随机偶联：与单个抗体存在80-100个赖氨酸的氨基相比，单克隆抗体IgG仅含有12个链内二硫键和4个链间二硫键。由于链内二硫键处于两层反向平行的β折叠结构间，缺乏溶剂暴露，反应性较低，难以偶联。链间二硫键高度暴露在溶液区，在还原剂的作用下，可产生8个具有亲核性能的巯基（-SH），因此结合位点较赖氨酸大幅减少，均一性大幅提升。然而，问题在于由于每个抗体最多含有8个有效负荷，生产出的ADC产品均一性依然会存在缺陷。

基于半胱氨酸的随机偶联

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定点偶联

为了提升ADC药物的均一性和稳定性，制药公司开始从定点偶联的角度着手，希望能得到纯度更高的ADC药物。与随机偶联产生包含有效产物、无效产物甚至高度副作用产物的复杂混合物相比，定点偶联产生的ADC药物在体内肿瘤活性高，系统毒性低。

（1）Thiomab技术：

Thiomab技术为基因泰克的技术，原理为引入反应性半胱氨酸。通过基因工程技术在抗体特定位置插入半胱氨酸残基，将半胱氨酸的巯基（-SH）与小分子药物偶联，形成DAR为2、高度均一的药物。

Thiomab技术

（2）MAIA技术：

MAIA技术是Seattle Genetics和Spirogen受Thiomab技术的启发，研发出来的一项定点偶联技术。通过在mAb关键区域的239位引入突变的丝氨酸半胱氨酸，实现DAR=2的定点偶联。

MAIA技术

（3）ThioBridge技术：

ThioBridge技术由英国剑桥市Abzena公司首创，为二硫键改造技术。首先将单抗本身的二硫键还原，利用二溴（或二磺酸盐）与还原的链间二硫化物反应，以提供重新桥接的mAb，得到DAR为4的ADC药物。

Thiobridge技术

（4）非天然氨基酸技术：

新码生物的ARX788采用非天然氨基酸的定点偶联技术。非天然氨基酸的技术路线包括：第一、体外合成所需的非天然氨基酸；第二，非天然氨基酸进入细胞后，被tRNA运送到核糖体；第三，在核糖体中，tRNA可识别特殊密码子，将非天然氨基酸插入多肽链的特定位置。尽管技术路线复杂，但本质即是在目标蛋白的特定位点插入非天然氨基酸，由于非天然氨基酸的独特性，可为偶联提供定点的连接位点。

ARX788引入非天然氨基酸p-acetylphenylalanine（pAF，含有酮反应官能团），通过肟键偶联毒素AS269，DAR为2。试验数据显示，即使ARX788被内吞入细胞发生降解，ADC上的毒性药物分子依然牢固地与非天然氨基酸连接，展现出非天然氨基酸技术带来的超强稳定性。

非天然氨基酸技术

（5）利用酶的生物偶联

N糖基化和O糖基化：GlycoConnect技术由荷兰Synaffix公司首创，美雅珂通过协议获得了GlycoConnect技术的非排他性权益，并用于靶向CD20的MRG001和靶向HER2的MRG002研发中。GlycoConnect技术可利用天然抗体聚糖实现定点偶联和稳定毒素附着，生产出DAR为1、2、4的ADC药物。

GlycoConnect技术路线可分为三步：

第一，糖苷内切酶切除N端聚糖，保留糖胺。N端聚糖位于抗体Fc端，在抗体的免疫调节机制中（ADCC或CDC）发挥重要作用；

第二，Y289L突变的bovine β（1-4）-galactosyltransferase用来转运含叠氮（Azido）的糖到抗体；

第三，通过点击化学（Click Chemistry）反应drug-linker（药物-联接区）被偶联到抗体，最终产生DAR=2的ADC。

GlycoConnect技术路线

一种DBCO标记的抗体Fc靶向肽：中国科学院上海药物研究所黄蔚团队也研发出基于糖基化的定点抗体药物偶联物的新策略——一种DBCO标记的抗体Fc靶向肽。

该技术路线可分为两步：

首先，利用靶向肽与抗体Fc的亲和力，将其环张力炔基DBCO标记基团运输到K249附近。在此过程中，DBCO的酰化活性处于“笼缚”状态，不会与抗体发生随机偶联。

其次，在银催化下，DBCO重排，相应酰基选择性地修饰FC区域的K249，高效实现了抗体的定点偶联。

DBCO标记的Fc靶向肽应用于曲妥珠单抗上K249的定点偶联

除了以上介绍的定点偶联技术外，科伦药业的A166采用赖氨酸定点定量偶联技术，石药集团的DP303采用工程设计改造谷氨酰胺转移酶定点偶联技术（mTGase），康泰伦特（Catalent）采用的SMARTag定点偶联技术等，均可以生成安全性高和稳定性佳的ADC药物。随着ADC药物的不断问世，偶联技术的不断优化将愈发成为关注的热点，未来，究竟哪家的ADC药物兼顾疗效显著和安全性良好的特点，让我们拭目以待。