细胞与基因疗法新“战役”：工艺瓶颈如何突破？

近日，CRISPR先驱张锋教授及其团队在《科学》发布的新成果，引发业界对基因治疗的新关注。从人体自身找到灵感，开发出全新的mRNA递送平台，解决递送问题，基因疗法在技术上又有了新突破。

随着国内首个CAR-T疗法复星凯特的奕凯达®（阿基仑赛注射液）获批上市，国内CAR-T细胞疗法进入商业化阶段。

未来3-5年有望迎来细胞和基因疗法药物管线爆发式增长阶段，但是受限于目前开发工艺复杂且进化速度慢，生产与工艺成为药企要解决的新难题。

01 基因疗法工艺瓶颈：质粒与病毒载体

“质粒和载体是基因疗法工艺中最为关键的两点。” Cytiva(思拓凡)大中华区研发总监杨红艳接受E药经理人采访时说道。

质粒广泛存在于生物界，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。基因治疗中最常采用的病毒载体往往是通过多质粒瞬转后包装生成，所以质粒和病毒载体的工艺开发和产业化解决方案是基因治疗领域迫切需要解决的瓶颈。

在基因疗法工艺中，质粒常常来源于大肠杆菌发酵体系。大肠杆菌菌株从复苏到进入反应器进行高密度发酵再到下罐，大约是3～4天的时间。“如何在有限时间内尽可能地实现稳定的高密度发酵，同时表达量也比较高，这是一个挑战，也是工艺比拼的关键。因为大肠杆菌的表达量越高，就意味着批次产能越高，从而带来质粒生成成本的下降，”杨红艳解释道。

大肠杆菌的生长和复制非常迅速，倍增时间大约在20分钟左右。在这个过程中，培养基和补料策略的优化，发酵罐的参数，比如温度、通气速率和搅拌速度等参数均会影响着大肠杆菌的生长。“如果这些工艺关键点进行了很好的开发和优化，将大肠杆菌的比生长速率控制在合理范围内，，整个发酵过程将非常稳定，罐内的泡沫现象也比较可控。目前Cytiva已建立基于一次性反应器的高密度大肠杆菌发酵工艺，并已广泛用于质粒的大规模生产，”杨红艳说道。

发酵结束后，需要对收集的菌体进行碱裂解和下游纯化，才能获得高质量的超螺旋质粒用于未来病毒载体的包装。大肠杆菌的裂解也非常具有挑战性，如何在密闭体系下提高动态碱裂解的效率和收率是菌体裂解的优化重点。

解决碱裂解的工艺挑战后，迎来的另一个问题是下游纯化工艺的建立。如何去除杂质，尽可能地获得高质量的超螺旋质粒也是工艺中要解决的问题。通常情况下，会采用层析的方式对杂质进行去除。不同的质粒会采用不同的层析方式，目前业界用的较多的是两步层析或三步层析。

获得高质量的质粒后，需要考虑的是如何建立病毒载体的生产路线。基因治疗中超过70%以上会使用病毒载体进行目的基因的递送。病毒载体中常用的病毒有：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、反转录病毒等。其他的非病毒载体递送有聚合物、脂质体、纳米材料,以及新兴的外泌体等。

以腺相关病毒载体为例，其制备需要从细胞培养开始。大约70%～80%的病毒载体使用的是HEK293细胞体系，10%～20%使用的是昆虫杆状病毒体系。目前HEK293细胞体系的培养有两种方式：贴壁培养或者悬浮培养。

近几年，细胞培养工艺开始逐渐从贴壁培养向悬浮培养方向转移，以便放大产能为商业化做准备。同时，悬浮培养可以做到无血清培养，更符合监管要求。

培养细胞达到一定密度后，使用特定的转染试剂将多质粒转染到HEK293细胞中包装生产病毒载体。在转染步骤中多质粒的彼此比例、转染试剂、转染温度及时间、细胞密度等因素会影响转染效率。

病毒载体生产的下游工艺包括细胞裂解、纯化、超滤浓缩、除菌过滤及罐装等。如何在下游工艺路线中，提高病毒载体的回收率以及终产品的质量，比如空壳病毒的去除，也考验着未来的基因治疗企业。

“针对行业需求，Cytiva已经建立了关于病毒载体，且是不同血清型，从细胞培养到转染以及下游纯化的研发和生产平台，以帮助基因治疗企业尽快推动工艺研发和放大生产，”杨红艳说到。

基因疗法的工艺环节众多，且每一环都影响着商业化后的治疗效果、规模和成本。如何更高效地生产质粒和病毒载体是基因疗法控制成本的关键之一。

02 细胞疗法工艺瓶颈：紧张的窗口期

细胞疗法作为一种“活”的药物，其生产到使用的整个流程对工艺的要求都很高。

“中国的CAR-T细胞疗法已经迎来商业化，自体CAR-T细胞疗法面临的挑战在于紧张的窗口期。从患者体内收集T细胞到制备完成CAR-T细胞后回输进入患者体内的时间非常有限。在这有限的时间完成CAR-T生产、质量检测放行和运输，不容任何闪失的，否则对患者来说可能错过了治疗窗口，所以对CAT-T的生产工艺流程要求非常高，”杨红艳说道。

在CAR-T细胞疗法商业化之前， CAR-T细胞的制备常常使用的是手动工艺和开放操作，这意味着对操作人员的熟练程度依赖性非常高，同时增加了污染风险。不同的操作人员甚至是同一操作人员制备出的CAR-T细胞可能存在较大的差异，难以保障工艺的稳定性。随着CAR-T细胞产品步入商业化阶段，必须考虑采用自动化工艺流程以及封闭操作，来解决工艺稳定性问题。自动且封闭的工艺流程加上全程数据的可追溯已成为各家生物技术公司技术实力高低的体现。

杨红艳表示，“对于Cytiva而言，我们所提供的细胞药物生产工艺解决方案基于自动化和封闭操作，同时通过ChronicleTM数字平台监控生产设备运行和供应链物流信息,实现全流程的数据完整及可追溯。我们也看到，目前已上市的CAR-T细胞疗法的工艺开发和生产采用的都是这样的思路。”

03 赋能升级：人才培养、厂房建设以及供应链扩能

工艺的开发、优化少不了有经验的人才，但由于细胞与基因疗法行业发展十分迅速，人才供不应求。对于生物技术公司来说，拥有经验丰富的人才是最为核心的竞争力。

杨红艳介绍道：“我们在和客户合作开发工艺流程过程中，从启动项目的第一天起，我们就会邀请客户来现场与我们一起实施。基于这种完全透明的合作方式，将我们对于工艺开发的思考和经验分享给客户并做培训，实现未来他们可以自己生产的目标。对于初创型公司来说，不仅可以顺利完成在研产品的开发还完成了人才培养，实现了技术的无缝对接和转移。”

随着中国加入ICH，对于临床试验和生产等方面的标准逐渐向国际看齐，快速进行GMP厂房的建设也是走向商业化的保障之一。然而GMP厂房的建设并不是一件简单的事，考验着建设者对于生产标准、未来产能、生产线之间的协调等掌控能力。

“我们不仅会对技术人员进行培训，还会给客户提供厂房搭建经验，确保他们能在更短时间内搭建出符合标准的厂房，解决产品供应问题。”杨红艳补充道。

2020年初新冠疫情爆发以及越来越多的药品进入商业化生产，加剧了对生物制药企业对设备和消耗品的需求，目前全球供应链处于非常紧张状态。据悉，Cytiva为了解决供应链问题，将在全球持续投入15亿美元，以扩充不同产品的产能，包括培养基、层析填料、一次性耗材以及人力扩充。

除了向供应链环节投入15亿美元外，Cytiva联合E药经理人主办了“Think Big 2.0笃行思远双选平台”生物医药创新项目路演大会，助力生物医药产业创新公司的发展。该活动第一场分站路演将于2021年9月11日在杭州医药港举办，目前Think Big 2.0导师团名单已公布。