治疗性抗体工程的过去、现在与未来

治疗性抗体（Abs）是用于诊断和治疗各种疾病（如癌症、炎症性疾病和自身免疫）定制的生物制剂，可通过与特定抗原（Ag）结合来激活或抑制与特定疾病相关的生物学过程，包括可以用来阻止癌细胞的增殖。

迄今为止，市场上共有约711种治疗性抗体，其中99种药物已经获得美国食品和药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的上市批准。由于治疗性抗体具有高亲和力和特异性、低免疫原性以及针对一系列生物分子的能力，新一代治疗性抗体的开发也一直受到了外界的广泛关注。

01治疗性抗体的类型

根据抗体制造和创建的方式，治疗性抗体可分为两大类——多克隆抗体和单克隆抗体。

多克隆抗体

多克隆抗体（pAbs）是由免疫细胞的异质混合物产生的，并可直接从免疫动物的血清中获得。因此，它们可与同一抗原的不同靶表位结合。在这种混合物中，一些抗体结合到目标靶位，而另一些抗体与脱靶表位结合，所以不同批次多克隆抗体针对同一抗原的性能将会是可变的。

多克隆抗体的生产相对比较廉价和快速，然而细胞一旦耗尽，同一批次的抗体就无法复制。多克隆抗体具有高度亲和力、对抗体微小变化的耐受性（如轻微变性、多态性、糖基化的异质性等）以及稳健的检测能力，因此它们在研究和诊断中得到了广泛的应用。

单克隆抗体

单克隆抗体（mAbs）则是从培养细胞中纯化而来，因此它们可以特异性地与独特的抗体表位结合。与多克隆抗体相比，单克隆抗体的生产成本昂贵且耗时，但它们自身也具有许多优点，比如高特异性和可重现性。此外，单克隆抗体只要保留原始细胞系，就可以无限数量地持续生产，这些特征也使它们对治疗目的非常有用。

一个典型抗体分子的结构包括一个与免疫细胞相互作用的不可变结构域（C）和一个包含抗原结合位点的可变结构域（V）。在过去的46年里，市面上已经开发了4种类型的单抗，这些抗体的两个结构域的组成也有所不同。据估计，在临床应用中，小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和人类单克隆抗体，分别占所有单克隆抗体份额的2.8%、12.5%、34.7%和51%。人类和人源化单克隆抗体由于其具有低免疫原性和高耐受性，在当前被更频繁地用于临床治疗。

表：不同类型单克隆抗体的组成

02治疗性抗体的应用

目前，治疗性抗体主要被用作研究试剂、诊断工具和生物制药。

免疫分析

免疫分析是一种使用抗体来检测分子（蛋白质、激素、药物等）的生化测试和诊断方法，即通过目标分子中的抗原与其抗体之间的结合的方式进行定量试验。多克隆抗体和单克隆抗体都可被用于免疫分析。常用于诊断的免疫分析方法有以下几种。

（1）ELISA：是一种使用酶偶联抗体来检测目标分子的定量试验，可用于诊断多种传染病，如艾滋病。

（2）LFT：是一种定性测试，通常是在一条纸上包含不同颜色的珠偶联抗体。研究样本被加载在条带的一端，横向流动直到它到达抗体端。该方法可用于诊断传染病（如Covid-19新冠肺炎），不过最常见的LFT检测用途是家庭自用型妊娠测试。

（3）Westernblot：是一种基于凝胶电泳分离蛋白质和使用特异性偶联抗体半定量检测手段。它被广泛应用于研究中，也是一种有效的早期诊断工具。然而，由于它的制造是一个精密、昂贵且耗时的过程，因此该方法在医疗保健中的应用并不广泛。

（4）流式细胞术：用于分离和表征一个群体中存在的不同细胞类型。用特定的荧光共联抗体，标记不同类型的细胞，然后用激光束分离。该方法被用于癌症诊断，以检测患者体内是否存在肿瘤细胞。

肿瘤

目前，在FDA和EMA批准的所有单克隆抗体中，有44%用于治疗不同类型的癌症。单克隆抗体可以通过不同的机制诱导癌细胞死亡，包括中和、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADDC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）。此外，单克隆抗体还可以偶联到放射性同位素、毒素、药物、细胞因子或脂质体上，从而使细胞毒性药物能够以局部浓度更高的方式传递到受影响的组织，而不会对正常细胞造成损伤。

最近，双特异性抗体在临床和临床前发展中，也显示出了巨大的前景。它们具有一个靶向肿瘤相关抗原结合位点和另一个与免疫细胞受体结合的位点，从而使得免疫细胞能够靠近肿瘤细胞，确保免疫反应集中在病变组织位点。

炎症和自身免疫性疾病

治疗性单克隆抗体也可用于治疗炎症和自身免疫性疾病，包括克罗恩病、类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、牛皮癣、系统性红斑狼疮和1型糖尿病等。到目前为止，FDA和EMA批准的所有单克隆抗体中，有36%用于治疗不同类型的炎症和自身免疫性疾病。单克隆抗体被设计成可结合和中和促炎因子（如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素受体、整合素、细胞因子和抗原），并防止它们加剧炎症或免疫反应。

然而，大多数炎症性和自身免疫性疾病的病因是复杂的、尚不清楚的。目前针对这些疾病的药物和生物制药大多是广泛作用和起效的，而且不具有疾病特异性，因此该疗法会造成一些不良副作用（如感染和肿瘤增殖）。对这些疾病背后复杂的细胞和分子机制的进一步研究，将有助于设计更好的治疗性抗体。

传染病

抗体用于治疗传染病开始于120多年前，当时使用了来自免疫动物的血清。虽然高特异性使它们成为对许多传染病有价值的治疗选择，但抗体生产成本昂贵，市场相对较小。因此，获得更便宜的疗法（如抗病毒药物或抗生素）阻碍了它们在这一领域的扩张。

尽管如此，仍有7种单克隆抗体已经获得了FDA和EMA的批准，1种用于治疗艾滋病毒，2种用于治疗吸入性炭疽，1种用于预防呼吸道合胞病毒，1种用于预防艰难梭菌感染，2种用于治疗埃博拉病毒感染。此类抗体占监管机构批准的所有抗体的5.6%。

图为FDA和EMA批准的不同治疗领域单克隆抗体（截至2021年8月）

03抗体工程技术

小鼠单克隆抗体

治疗性单克隆抗体的时代始于1975年，当时科勒和米尔斯坦开发了杂交瘤技术。杂交瘤是由免疫B细胞和癌症（骨髓瘤）细胞融合形成的永生化B细胞。1986年，使用该技术生产的第一个治疗性抗体Orthoclone OKT3（莫罗诺马抗-cd3），被批准用于器官移植。不幸的是，受高免疫原性的影响，随后该疗法被停用了。

嵌合体单克隆抗体

1984年，莫里森和他的同事们使用重组DNA技术开发了一种小鼠-人嵌合单抗。

1994年，第一个嵌合治疗性抗体ReoPro（阿昔昔单抗）被批准为血小板聚集抑制剂。

人造单克隆抗体

与此同时，科学家们正在进一步开发人源化抗体来克服免疫原性反应。1986年，Jones和他的同事成功地将抗体的抗原结合位点（称为互补决定区域或CDR），从小鼠抗体中移植到人类抗体的相应区域。这样，他们将抗体的人源化比例提高到85%至90%，并进一步降低了免疫原性。1997年，首个人源化治疗性抗体Zenapax（达利珠单抗）被批准用于器官移植。

人类单克隆抗体

完全人源化的单克隆抗体的开发采用了两种不同的技术。

第一种技术是一种被称为噬菌体显示的体外筛选技术，是由温特及其同事于1990年开发的。通过将人类基因整合到噬菌体（一种感染细菌的病毒）中，这项技术使研究人员能够选择几乎具有任何特异性的单克隆抗体。第一个使用噬菌体显示的治疗性人单抗于2002年获得批准，Humira（阿达木单抗）用于自身免疫性疾病的治疗。

第二种技术是由格林和他的同事在1994年开发的技术，涉及创建表达人类抗体库的转基因小鼠。第一个来自转基因人源化小鼠的治疗性单抗于2006年获得批准，Vectibix（帕尼单抗）用于治疗转移性结直肠癌。该技术的一个缺点是，由于抗原加工和受到B细胞调控的小鼠遗传因素影像，获得的单克隆抗体可能不如人类中自然产生的抗体特异性。为了克服这个问题，研究者们使用完整的人类免疫系统创造的工程单克隆抗体，设计了新的方法。这些技术包括人类杂交瘤技术和通过EB病毒转化而实现的人类B细胞的永生化。然而，这些方法通常不适合筛选大型抗体库。

双特异性抗体

双特异性抗体被设计成可结合两个目标靶点，因此可以发挥两种不同的功能。第一个双特异性抗体是由尼森诺夫和他的同事在1960年开发的。不过直到2009年，双特异性抗体Removab（卡图马索马抗）才在欧洲被批准用于治疗恶性腹水的实体肿瘤患者。由于商业原因，它最近被从市场上撤出了。2014年，另一种双特异性抗体Blincyto（blinatumomab）被FDA批准用于急性淋巴细胞白血病的治疗。

纳米体

纳米体又称单结构域抗体，是来自骆驼和鲨鱼的小单链抗体。纳米体比抗体更小、更稳定，生产起来更简单、更便宜。2019年，第一个治疗性纳米体Cablivi（卡普利珠单抗-yhdp）被批准用于治疗血栓性血小板减少性紫癜。合成纳米体（合成体）目前正在开发中，预计可用于治疗Covid-19患者。

04单克隆抗体抗体生产技术

杂交瘤技术

杂交瘤的产生始于动物对特定抗体的免疫，接下来进一步收集这些B细胞并与一个永生化的细胞系（通常是骨髓瘤细胞）融合。这些杂交细胞经过筛选和选择，可以产生独特单抗的体外杂交瘤。如果细胞的供体来自小鼠，该技术可以产生小鼠、嵌合和人源化单克隆抗体；如果细胞的供体来自表达人类基因的转基因小鼠或人类受试者，则可以产生人类单克隆抗体。

噬菌体展示技术

这项技术从人类血液中分离B细胞开始，接下来用PCR扩增抗体编码的基因，并插入到噬菌体的外壳蛋白基因中。这些基因工程噬菌体在其表面显示外来蛋白抗原，用于感染细菌进行繁殖。通过这种方式，就可以创建显示不同单克隆抗体的大型噬菌体库。随后对细胞进行筛选，并使用特定的抗原分离抗体。这种技术有可能产生任何类型的抗体，包括不能用于动物免疫的有毒物质。近年来，研究界已经在此基础上建立了其他类似的显示系统。

（1）细菌展示技术：可以依赖于候选抗体与细菌细胞表面蛋白的基因融合。该系统的一个优点是增长速度快，处理容易和成本高效。然而，由于转化效率低，阻碍了其广泛的适用性。

（2）酵母菌展示技术：可以依赖于候选抗体与酵母细胞表面蛋白的基因融合。该系统与荧光激活细胞分选（FACS）兼容，允许对候选库进行实时分析。然而，这些库往往比其他显示技术规模更小。

（3）哺乳动物展示技术：包括使用复杂的基因工程工具，如CRISPR/Cas9或转座子技术，用编码候选抗体的质粒转染哺乳动物细胞。流式细胞仪也可以对细胞库进行实时分析。该系统的一个优点是，分泌的抗体含有人类PTMs，从而最大限度地减少了潜在的免疫原性问题。然而，该技术的一个限制是，与其他展示系统相比，细胞增长速度较慢。

（4）核糖体展示技术：是一种无细胞的体外技术，包括使用细胞提取物（原核生物或真核生物）翻译候选抗体的mRNA。在翻译过程中，mRNA保持附着在核糖体上的状态，而目标蛋白质则相对突出并折叠。然后再使用固定化抗原选择mRNA-核糖体-抗体复合物。经过选择后，仍然附着在复合物上的mRNA被逆转录回cDNA并开始扩增。这种技术的一个优点是不受宿主的转换效率的限制，允许生成和筛选更大的库。

在上述展示技术获得的所有单克隆抗体中，噬菌体展示技术仍然是主要的方法。与此同时，使用其他显示方法发现的几种单克隆抗体也正在临床试验中。2018年，第一个通过酵母展示技术获得的单抗在中国内地被批准用于治疗霍奇金淋巴瘤。

基因工程细胞培养技术

在过去的几十年里，细胞培养技术也取得了显著的进步，今天大多数治疗性抗体都是使用基因工程的永生化细胞系生产和稳定表达人类抗体基因，而这其中，雷子中国仓鼠卵巢CHO细胞系是最常用的。然而，使用非人类细胞系的一个问题是，重组抗体将包含可能具有潜在免疫原性的非人源PTMs。这就是为什么使用人类细胞系现在正成为研发的重点，目的就是要克服这种缺陷。

表：不同技术生产单克隆抗体的优劣比较

05治疗性抗体的未来及挑战

自35年前第一个治疗性单抗获得批准以来，单抗的开发经历了前所未有的增长。目前，治疗性抗体已经成为生物制药市场的主导力量。2020年，全球单抗市场规模估计为1435亿美元，预计2028年将增长到4518.9亿美元，复合年增长率高达14.1%。

然而，治疗性抗体的研发和制造仍然是一个漫长、困难和昂贵的过程。该领域目前必须克服的一些挑战，并且需要以较低的成本，大量生产稳定的抗体产品。目前，制药厂商也正在加强稳定性和发展更好更灵活的技术方面做出巨大努力。尽管存在诸多挑战，在可预见的未来，治疗性抗体一定将继续保持一种主导的治疗方式和市场地位。