Nature深度综述展望PROTAC未来20年的四大发展方向

首个PROTAC分子的论文发布之后的20年里，这一技术从学术界转化为临床前和临床期新药开发项目，并且在2019年首次在肿瘤学领域获得临床概念验证。在过去的2021年，PROTAC等蛋白降解技术是生物医药行业的热词之一。辉瑞、拜耳、百时美施贵宝、礼来等大型药企也在这一领域纷纷布局。

近日，蛋白降解领域明星公司Arvinas的联合创始人之一，耶鲁大学的Craig M. Crews教授和合作伙伴联合在Nature Reviews Drug Discovery上发表深度综述，展望了PROTAC靶向蛋白降解技术未来20年的发展方向。作者们指出，靶向蛋白降解领域已经“整装待发”，挑战此前被认为“不可成药”的靶点。

PROTAC技术发展的历史和目前的临床开发状态药明康德内容团队已经在多篇文章中做过介绍。今天的这篇文章里，药明康德内容团队将着重与读者分享这篇综述中，作者列出的PROTAC靶向蛋白降解技术未来20年的四大发展方向。

确立最适合蛋白降解的靶点类型

第一波临床期蛋白降解剂的靶点为已经获得临床验证的成熟靶点，比如Arvinas公司选择的雄激素和雌激素受体。针对这些靶点的成功确立了蛋白降解剂成为一种治疗模式。然而，这一治疗模式真正的潜力在于触达目前治疗模式难于成药或不可成药的靶点。那么哪些靶点是PROTAC疗法的理想靶点。综述总结了PROTAC靶点的几大常见特征，它们包括：

蛋白的过度表达、突变、聚集、异构体表达或细胞内定位，以功能获得性的方式导致疾病；

具有能够被E3连接酶触达的结合表面；

如果有能够进入蛋白酶体的无结构区域则更为理想。

因为基因突变对常规靶向疗法产生耐药性的蛋白，具有骨架功能的蛋白和用其它治疗模式“不可成药”的蛋白也可能是适合使用PROTAC技术的靶点。

▲PROTAC靶点的特征（图片来源：参考资料[1]）

虽然适合使用PROTAC蛋白降解的靶点不需要一个酶活性位点，它们需要一个能够被E3连接酶触达的小分子结合位点。这一位点的亲和力不需要特别高，通常在1~500 nM的范围内就可以，募集的E3连接酶必须能够触达靶点的表面。

对于骨架蛋白来说，选择结合位点尤为关键，因为存在于复合体中的靶点蛋白只有部分表面暴露出来。对于那些大部分表面都隐藏在复合体中的靶点，靶向复合体中的邻近蛋白不失为一种策略。

虽然与靶点蛋白结合的配体的亲和力不需要很高，但是与E3连接酶结合的配体应该具有强结合力和缓慢的解离速度。能够与E3连接酶共价结合的PROTAC分子能够将三个部分（靶点，PROTAC分子和E3连接酶）组装的动态变化简化为两个部分（靶点，PROTAC/E3连接酶复合体），这可能增强催化效率。

扩展可用的E3连接酶

目前，第一波处于临床开发阶段的靶向蛋白降解药物大多倾向于募集名为CRBN的E3连接酶，一个值得关注的例外是Dialectic Therapeutics公司开发的BCL-XL降解剂DT2216，它募集了名为VHL的E3连接酶。不过，靶向蛋白降解的潜力让学术界和医药界都在探索新的E3连接酶。人体中有超过600种E3连接酶，综述指出，目前的问题是基于新E3连接酶的靶向蛋白降解疗法何时造福患者，用于治疗什么疾病，而不是它们会不会出现。

PROTAC分子的一个优势在于可以根据靶点，通过选择募集连接酶的分子和连接子（linker），理性设计蛋白降解剂。它的模块式特征意味着针对不同的靶点，可以替换与E3连接酶结合的模块，募集达到最佳治疗效果的E3连接酶。

虽然基于募集CRBN和VHL连接酶的PROTAC分子设计已经日渐成熟，它们的临床前和临床期开发仍然面对多重挑战。尤其在肿瘤学领域，对治疗药物的耐药性可以迅速出现，肿瘤可能通过产生基因突变，逃避依赖非必需连接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解剂的作用。临床前研究已经发现有些肿瘤能够通过在泛素连接酶系统的组成部分中引入突变或降低表达来逃避蛋白降解剂的作用。这些挑战给发现新的E3连接酶带来机会。那么，适合临床开发的新E3连接酶应该具有什么样的特征？我们应该从哪些方向寻找新的E3连接酶？综述作者提出了以下几个方向：

应用广泛，普遍存在的连接酶

这些连接酶和CRBN或VHL一样，能够与任何靶点蛋白匹配，从而用于治疗很多不同的疾病适应症。目前所有的PROTAC分子都只使用了少数几个这种类型的连接酶，它们的信息可以在线上数据库PROTAC-DB中查询。

有趣的是，针对同一靶点蛋白，募集VHL还是CRBN可能导致不同的降解效率。比如在针对KRAS G12C的蛋白降解剂开发方面，已有的研究发现KRAS G12C可以被PROTAC系统靶向，但是降解的效果会受到募集的E3连接酶是VHL还是CRBN的影响。

多个因素可能影响连接酶的降解特征，包括连接酶的构象和靶点蛋白之间的互补性；连接酶与靶点蛋白直接构成可导致降解的三元结构的能力；不同连接酶和靶点蛋白的细胞内定位；以及细胞类型特异性连接酶和靶点的表达。

综述指出，基于连接酶的结构特征，可以判断一些值得用于PROTAC蛋白降解的连接酶，而去年DeepMind和RoseTTAFold在基于氨基酸序列预测蛋白三维结构方面的突破，可能重新定义哪些连接酶可以用于开发蛋白降解疗法。

组织和细胞特异性E3连接酶

连接酶的组织和细胞特异性，以及在肿瘤中的富集程度和是否对肿瘤必不可少，可能为针对特定领域的蛋白降解疗法提供开发机会。学术界和医药行业都对发现具有独特表达特征的E3连接酶具有浓厚的兴趣，从而进行精准靶向蛋白降解（precision TPD），这是蛋白降解领域的“圣杯”之一。

以往的研究已经发现了一些在特定组织中表达的E3连接酶，比如名为RNF182和TRIM9的E3连接酶特异性表达在中枢神经系统（CNS）中，它们可能对于靶向神经元疾病具有重要意义。CNS特异性靶向降解可以避免全身性的脱靶和毒副作用。

有趣的是，有些连接酶在特定组织和细胞中表达水平特别低，这一特征对蛋白降解剂来说也可能提供机会。一个出色的例子是VHL在血小板中的表达水平低，因此募集VHL的PROTAC分子DT2216在降解BCL-XL的时候能够避免伤害到血小板，从而降低了血小板导致的毒性，提高了它的治疗指数。目前它处于1期临床开发阶段。

▲不同类型的E3泛素连接酶（图片来源：参考资料[1]）

在疾病组织或细胞中富集的E3连接酶

精准靶向蛋白降解的另一个前沿是特异性靶向肿瘤细胞的PROTAC分子。达成这一目标的一个策略是靶向肿瘤特异性或在肿瘤富集的E3连接酶。一般来说，在肿瘤中富集的E3连接酶与肿瘤依赖的E3连接酶重合。这一相关性可用于发现对于多种癌症细胞类型都必需的E3连接酶，它们的优势在于肿瘤细胞难于通过连接酶的突变来产生对PROTAC分子的耐药性。

不过，这类连接酶能否真正改善PROTAC分子的治疗指数还需要实验验证。一个潜在问题是在肿瘤中高度富集或者肿瘤依赖的E3连接酶大多跟细胞周期相关。基于这些连接酶开发的PROTAC分子可能产生和经典化疗药物类似的毒性，不过这一可能性仍然需要实验验证。

最后，癌症睾丸抗原（CTAs）也包括在正常组织中表达有限但是在多种癌症类型中高度表达的泛素连接酶，一个例子是黑色素瘤抗原基因（MAGE）家族中的泛素E3连接酶。

发现、研究和开发肿瘤特异性E3连接酶用于蛋白降解只是获得肿瘤特异性PROTAC分子的策略之一。另一种策略是利用抗体对肿瘤的特异性，将降解分子偶联在肿瘤特异性抗体上。基因泰克（Genentech）和其合作伙伴的研究已经展现出抗体偶联PROTAC分子的肿瘤靶向特异性。不过，抗体偶联PROTAC会失去小分子PROTAC的口服特征。

治疗肿瘤学以外的疾病

目前已经获批的蛋白降解药物（度胺类药物）和大多数新开发的临床期PROTAC分子和分子胶化合物用于治疗不同类型的癌症。然而，靶向蛋白降解的范围正在向肿瘤学以外的领域扩展。

炎症、免疫和免疫肿瘤学

在第一波进入临床开发阶段的降解剂中，Nurix公司的布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK）抑制剂NX-5948和Kymera公司的IRAK4降解剂（KT-474）将检验PROTAC治疗模式在非癌症疾病方面的应用。它们可以用于治疗多种免疫炎症疾病，比如类风湿性关节炎。

在免疫检查点抑制剂获得成功之后，开发能够激发抗癌免疫反应的小分子药物是药物开发的一个重要领域。PROTAC分子具有以小分子药物的模式激活免疫细胞，模拟PD-1/PD-L1靶向疗法效果，成为潜在“first-in-class”疗法的潜力。最近，靶向MAP4K1的PROTAC分子已经表现出可喜的临床前活性。

虽然在这个方面，小分子抑制剂可能达到同样的目的，但是PROTAC分子可能具有更好耐受性和更低的毒副作用。

神经病学和神经退行性疾病

PROTAC分子的关键性特征之一是能够降解因为没有活性位点而不被传统小分子抑制剂靶向的蛋白。这一特征让在多种神经退行性疾病中积累的蛋白（比如Tau蛋白，α突触核蛋白，亨廷顿蛋白突变体…）成为潜在靶点。

Tau蛋白病（Tauopathies）是一类小分子药物难于靶向，但是PROTAC分子可以有所作为的疾病领域。它们包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆（FTD）等神经疾病。这些疾病的病理与异常Tau蛋白的聚集和累积相关，产生的神经原纤维缠结可导致神经元的死亡。

降低Tau蛋白的水平是正在被积极探索的一个研发方向，在临床前模型中，使用反义寡核苷酸（ASO）疗法已经成功降低Tau蛋白水平并逆转Tau蛋白相关病理。开发靶向Tau蛋白的PROTAC分子或其它小分子降解剂可以把降低Tau蛋白水平的表型与全身性给药和穿越血脑屏障的特征结合在一起，目前是一个尤为受到关注的领域。

Tau蛋白单体是一个天然无序蛋白，没有明确的供小分子药物结合的“口袋”。然而，小分子探针能够与Tau蛋白的寡聚体结合，目前已经作为试剂用于PET扫描。一个策略是将这种PET跟踪剂改装成募集CRBN的PROTAC分子，它在细胞培养模型中已经表现出降解Tau蛋白的能力。

在帕金森病患者中积累的α突触核蛋白与Tau蛋白类似，也是一种天然无序蛋白。此前的研究已经报告了一款基于多肽的α突触核蛋白降解剂，它在实验中保护神经元不受α突触核蛋白过度表达引发的神经毒性的伤害。

抗病毒PROTACs

抗病毒PROTAC分子的可行性最初在降解丙肝病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶的研究中得到确立。随着新冠病毒的出现，这一策略也被用于靶向新冠病毒。新冠病毒的主要蛋白酶（Mpro和PLpro）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）目前被小分子抑制剂靶向。它们可能成为PROTAC分子的潜在靶点。

Nurix Therapeutics公司目前正在开发针对新冠病毒的三款蛋白降解剂。

开发创新PROTAC模式

创新PROTAC策略，包括基于生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和杂合体PROTACs（hybrid PROTACs）可能进一步扩展PROTAC可以靶向的靶点范围。这篇综述中将PROTAC分子划分为三类，传统的小分子PROTACs，包含多肽或其它生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和同时包含多肽和传统小分子“弹头”的PROTACs（杂合体PROTACs）。

生物制品PROTACs利用多肽、融合蛋白、以及寡核苷酸等作为识别靶点的配体。基于融合蛋白或者多肽的PROTACs已经在研究中成功降解HER2、MYC、KRAS等与癌症相关的靶点。基于寡核苷酸的PROTAC可以用于靶向转录因子和RNA结合蛋白。这些蛋白如果出现突变，会导致多种类型的癌症，以及肥胖症、心血管和神经疾病。

这些生物制品PROTACs有潜力成为一种新的治疗模式，不过它们的递送和给药模式是需要跨越的障碍。这些疗法可能需要以基因疗法的方式递送，利用精准调控的启动子来控制细胞内的表达水平。基于纳米颗粒的递送技术和基于病毒载体的基因递送系统的发展将在这一治疗模式的进展中起到重要作用。

短期来看，生物制品PROTACs可以作为工具分子，驱动小分子PROTACs的开发，它们可以用于确认降解蛋白带来的完全抑制与小分子抑制剂导致的部分抑制相比，能否带来更好的生物学效果；或者比较蛋白表达后降解与利用RNAi抑制蛋白表达之间的生物学区别；还可以用于确定靶点蛋白的哪个表面能够被E3连接酶触达。

PROTACs也激发了科学家们利用非蛋白酶体的降解系统，开发靶向蛋白降解剂的努力。目前已经有LYTAC，ATTEC等多种其它降解模式被开发出来，它们具有各自独特的特征。

▲不同靶向蛋白降解策略作为治疗模式的特征（图片来源：参考资料[1]）

结语

作者表示，基于靶向蛋白降解在过去20年的进展和学术界与工业界对它的兴趣和投入，很明显这一技术可成为一种关键性治疗模式。他们相信，这一治疗模式具有为广泛疾病患者提供创新治疗选择的潜力。