小分子抗新冠药物的突破性研究进展

文丨小泥沙

席卷全球的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19, 简称新冠肺炎)由一种新型单链RNA冠状病毒引起，国际病毒分类学委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将该病毒命名为SARS-CoV-2。SARS-CoV-2 的生命周期主要包括病毒附着、膜融合、基因组复制、病毒粒子组装和释放。当前，针对 SARS-CoV-2 的药物研发主要以病毒生命周期中的一个或多个事件为靶标来阻止病毒复制，如阻断刺突蛋白与血管紧张素转化酶 2（ACE2）结合和抑制病毒膜与宿主细胞融合或抑制3CL 蛋白酶（3C-likeprotease, 3CLpro）和木瓜蛋白酶（PLpro）或抑制依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）等。现阶段针对 SARS-CoV-2 的口服小分子药物已取得突破性进展，多种治疗药物已进入Ⅲ期临床试验。

RNA聚合酶（RdRp）抑制剂

1 莫努匹韦（ molnupiravir）

莫努匹韦(molnupiravir, MK-4482, EIDD-2801)是2021年11月4日英国药品与健康产品管理局(Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency, MHRA)批准上市的第一款用于成年人轻度至中度新冠感染治疗的RdRp口服抑制剂药物。莫努匹韦在整个临床试验(Ⅰ~Ⅲ期：NCT04392219、NCT04405570、NCT04405739、NCT04939428、NCT04575597、NCT04575584)中均表现出针对新冠肺炎患者较理想的治疗效果和安全性。莫努匹韦在SARS-CoV-2感染的Vero细胞中的抗病毒药效约为EC50=0.3 μmol/L，在人呼吸道上皮细胞中抗病毒复制的药效为EC50=0.14 μmol/L。体外毒性数据显示，针对Vero细胞的CC50>10 μmol/L，毒性与药效的安全窗口较为理想，因此莫努匹韦被选定为临床候选化合物。科学家在药效机理研究中发现，莫努匹韦能有效插入SARS-CoV-2病毒的RNA模，促进病毒的突变和复制终结。细胞培养中的临床前数据显示，发生G到A和C到U转换突变的病毒RNA数量在莫努匹韦作用下剂量依赖性增加，这与莫努匹韦的抗冠状病毒药效成正相关。因此，莫努匹韦被归类为诱变核苷酸类似物。科研人员用SARS-CoV-2纯化的RdRp蛋白酶结合病毒RNA复制测试评价，研究了药物潜在的生化机制，即莫努匹韦作为前药在血浆中代谢为N 4-羟基胞苷(EIDD-1931)，该活性主体分子进入宿主被感染细胞后，经激酶磷酸化形成N-羟基胞苷三磷酸作为药物活性成分，参与病毒RNA复制过程并诱导RNA复制突变体的产生，最终导致病毒复制终止。

2021年3月默克公司(Merck)的Ⅱ期临床结果显示，从第5天接受该药治疗的新冠肺炎患者，在所有剂量组均达到了病毒阳性检出率为0%(安慰剂组为24%)的效果。最新的Ⅲ期临床结果显示，莫努匹韦受试者在死亡和住院风险两项指标中均降低了50%. 接受莫努匹韦治疗的患者在随机分组后的第29天住院或死亡的概率为7.3%，而安慰剂治疗的患者为14.1%。在安全性方面，莫努匹韦治疗组因药物相关不良事件而终止治疗的受试者约为1.3%，治疗组和安慰剂组发生任何级别不良反应的比率分别为35%和40%。

2 瑞德西韦（ remdesivir）

瑞德西韦(remdesivir, GS-5734)是美国吉利德科学公司的一款在研核苷类似物前药，可以从核糖衍生物经由多步反应合成获得，为一种核苷类似物的前体药物，通过RdRp 有效地结合到新生 RNA 链中，从而导致病毒复制提前终止。对丝状病毒和冠状病毒等多种病毒科病毒具有广谱抗病毒活性，半最大效应浓度（EC50）值范围为0.0035～0.75 μmol/L-1。体外试验已证实瑞德西韦对 SARS-CoV-2 的有效抗病毒活性。瑞德西韦通过静脉给药，30～120 min 输注，其在血浆中很容易检测到，并在输注结束时达到峰值浓度，随后迅速消失（中位时间 0.5～1 h）。在体外试验中，瑞德西韦可以抑制SARS-CoV-2(在Vero E6细胞中的EC50=0.77 μmol/L)。但是针对该药物有效性的临床研究产生了前后矛盾的结果。基于自适应性COVID-19治疗试验(adaptive clinical design)的结果，美国FDA已经批准该药物治疗COVID-19住院患者。而世界卫生组织基于“团结实验项目(solidarity clinical trial)”则认为，该药物在提高患者生存率或降低患者对吸氧的需求等方面没有产生有意义的影响。

瑞德西韦是被批准用于治疗 COVID-19 的第一个药物，已在日本、澳大利亚、韩国、加拿大、以色列等全球多个国家注册批准用于治疗 COVID-19 患者。根据药物作用机制及目前已有研究结果表明，瑞德西韦对重型/危重型患者效果差，临床治疗时应尽早、及时应用。但其给药方式的局限，限制了临床早期用药。

3 法匹拉韦（ favipiravir）

法匹拉韦(Favipiravir, T-705)被用于新发或复发流感的治疗。工业上主要以3-氨基吡嗪-2-羧酸为原料，经羟基化、酯化、氨解、硝化、还原、重氮化等反应制得，收率较低，生产成本较高。法匹拉韦是一种前药，作为一种鸟嘌呤类似物，在进入受感染细胞后，通过模拟鸟苷三磷酸(GTP)嵌入延伸的RNA链中竞争性抑制RdRp，从而抑制病毒基因组的复制和转录，实现抗RNA病毒(例如流感病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、奇昆古尼亚病毒、诺如病毒和肠病毒等)的作用。鉴于它对SARS-CoV-2也具有良好的体外抑制活性(在Vero E6细胞中EC50=61.88 μmol/L)，法匹拉韦于2020年5月率先在印度获得了新冠肺炎治疗的“紧急使用授权”，随后俄罗斯卫生监管部门也赋予了该药物针对新冠肺炎患者的紧急使用授权。法匹拉韦在日本已经完成了针对新冠肺炎危重病人的Ⅲ期临床试验，目前正处于“预注册”阶段。法匹拉韦在临床阶段的结果仍存在争议，不过在预催化状态下与SARS-CoV-2的RdRp复合物冷冻电子显微镜结构研究发现，该药物除非在模板RNA中遇到重复的嘧啶残基，否则RNA产物中法匹拉韦的存在不会立即终止生长链的延伸，并且法匹拉韦能够逃脱转录复制复合体(replication and transcription complex, RTC)的校对机制，导致后代病毒基因组发生突变，从而发挥抗病毒功效。这一发现解释了该药物在体外没有显著抑制RNA合成的现象。

目前，日本、俄罗斯、沙特阿拉伯、泰国、肯尼亚等国已在指南中推荐轻度至中度 COVID-19 患者使用法维拉韦口服治疗。值得注意的是，法维拉韦对有生殖需求、痛风史和高尿酸的患者要谨慎使用，对于过敏、严重肝损害和肾损害的患者，禁用该药。但结合药物作用机制及多项临床试验的乐观研究结果，法维拉韦仍有望成为 SARS-CoV-2 抗病毒治疗的新选择。

蛋白酶抑制剂

1、3C样胰凝乳蛋白酶（3CLpro）抑制剂

3C样胰凝乳蛋白酶(3C-like protease, 3CLpro,Mpro, nsp5)亦称为M蛋白酶，是病毒复制过程必需的功能蛋白。该蛋白酶通过水解多聚蛋白pp1a、pp1ab中至少11个保守位点，以保证病毒转录复制关键非结构蛋白nsp4~16的生成，其中包括RdRp、解旋酶以及Mpro自己，并且Mpro不同毒株之间具有高度同源性而与人类宿主细胞缺乏同源性。因此，M蛋白酶也被认为是抗病毒药物开发的重要靶点之一。

美国辉瑞公司研究人员以SARS-CoV-2 Mpro为靶标，设计和筛选出了具有强效病毒抑制作用的临床候选药物PF-07321332。其在体外实验中针对SARS-CoV-2 Mpro的酶抑制常数Ki为3.11 nmol/L，酶抑制活性为IC50=18.0 nmol/L，而针对SARS-CoV-2病毒感染的抗病毒活性为EC50=74~93 nmol/L。PF-07321332在临床前试验中具有比较低的口服生物利用度，在大鼠和犬的药代动力学实验中生物利用度保持在20%~25%，其原因在于PF-07321332本身是体内药物代谢酶CYP3A4的代谢底物。鉴于此，在临床试验中采用了与CYP3A4强效抑制剂瑞托那韦(ritonavir)联用的策略(NCT04756531)，以提高药物在体内的半衰期和生物利用度。药物与SARS-CoV-2的晶体结构显示，药物分子中的CN取代基以共价方式与蛋白酶中的Cys145残基结合，但该共价结合模式在非可逆SARS-CoV-2抑制剂竞争实验中被证实是一种可逆模式。

目前，已经完成了PF-07321332针对轻度及中度症状新冠病毒感染者的Ⅲ期临床试验研究。结果显示，在1219名未接种新冠疫苗的成年患者中，发热、干咳等新冠肺炎症状出现后3 d内服用本抑制剂的住院率从安慰剂组的7%降至0.8%，死亡率从1.8%降至0%。本药物已于2021年11月申请美国FDA的紧急使用授权。

2、木瓜样蛋白酶（PLpro）抑制剂

PLpro是剪切经宿主细胞翻译机制表达的多聚蛋白pp1a和pp1ab的两个关键蛋白酶之一(PLpro负责切割nsp1、nsp2和nsp3)，可以高活性地切割Lys48连接的多聚泛素和泛素样分子干扰素刺激基因15(ISG15)的修饰来实现免疫逃逸。因此，当PLpro被抑制后，理论上可以实现病毒载量的降低以及宿主先天免疫系统的恢复。因其在病毒复制和宿主细胞控制中的多重作用，PLpro被认为是一个潜在的抗病毒靶点。

GRL0617最初是在2003年SARS暴发时开发的PLpro抑制剂。由于SARS-CoV-2的PLpro与SARS-CoV PLpro具有82%序列相似性和90%的结构相似性，研究人员针对前期具有SARS-CoV抑制活性的化合物开展了SARS-CoV-2抗病毒活性筛选。研究显示，在SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞中100 μmol/L的GRL0617能有效抑制SARS-CoV-2的胞内复制，抑制率达50%以上。为了验证化合物的抗病毒复制作用与靶标的相关性，对其进行了体外细胞测试并获得了该药物与PLpro的共晶结构。体外测试结果表明，该抑制剂针对SARS-CoV-2的PLpro蛋白酶具有较强的抑制活性(IC50=2.1 μmol/L)，并且在Vero E6细胞中该药物浓度达到100 μmol/L时无明显的细胞毒性。

在当前COVID-19全球大流行以及SARSCoV-2 持续变异的背景下，研发出有效、安全的抗病毒药物并广泛推广应用是降低疾病全球负担的重要举措。小分子药物具有易吸收、分子体积小、能够穿透细胞膜、易于大规模工业化生产的优点，预期未来这类药物可在早期广泛应用，降低重症化率、降低病死率以及为早日战胜新型冠状病毒做出重大贡献。