PROTAC联合CRISPR筛选 在这一抗癌领域大有可为

以PROTAC为代表的靶向蛋白降解疗法是新药开发的热门领域之一。据不完全统计，今年已经有24款靶向蛋白降解疗法进入临床开发阶段。近日，英国邓迪大学（University of Dundee）的Alessio Ciulli教授团队发表一篇综述，盘点了使用PROTAC疗法，靶向表观遗传学靶点的现状，并对未来进行了展望。作者表示，CRISPR筛选与PROTAC技术的结合，为开发靶向表观遗传学靶点的蛋白降解疗法提供了有力的工具。Ciulli教授也是初创公司Amphista Therapeutics的科学创始人，它在去年完成5300万美元的B轮融资，致力于开发下一代靶向蛋白降解平台。

表观遗传学在疾病病理中的作用

表观遗传学过程包括对DNA、DNA相关蛋白，以及RNA的修饰，这些修饰不改变基因序列，但是影响基因的表达。比如，对DNA的甲基化与基因沉默相关，很多对组蛋白的修饰在转录调节、DNA复制和修复、RNA剪接和染色体凝聚过程中发挥重要作用。

表观遗传学在疾病病理方面的作用也早已被确立，比如组蛋白脱乙酰酶（HDACs）在癌症中高度表达。表观遗传学蛋白的功能缺失性或获得性突变也经常驱动疾病病理学。历史上，针对表观遗传学的抑制剂开发也获得过成功，目前已经有7款靶向表观遗传学蛋白的抑制剂获得美国FDA的批准上市。最近获批的一款新药为首款靶向组蛋白赖氨酸甲基转移酶EZH2的抑制剂tazemetostat。

▲获得FDA批准靶向表观遗传学蛋白的抑制剂（图片来源：参考资料[1]）

然而，开发靶向表观遗传蛋白的抑制剂面对多重挑战，主要限制之一是许多表观遗传蛋白家族的催化蛋白域或蛋白-蛋白互作域的结构高度保守，这让开发靶向特定亚型的抑制剂变得非常困难，一个典型例子是BET蛋白。限制抑制剂应用的另一个局限是表观遗传学蛋白通常包含多个蛋白域，并且经常是由多个亚基构成的蛋白复合体的一部分。这些特征意味着使用抑制剂来阻断单一催化活性或者一种相互作用，并不足以改变复合体的功能结果，因为还有许多其它活性或相互作用不受抑制剂的干扰。

▲开发小分子抑制剂调节表观遗传学过程面对的挑战（图片来源：参考资料[1]）

遗传学筛选带来的突破

基于RNA干扰（RNAi）和CRISPR基因编辑技术的遗传学筛选为表观遗传学的靶点发现带来了革命性的变化，这些技术让科学家们可以系统性地敲低或者敲除基因组中单个基因的表达，从而发现表观遗传学蛋白缺失的作用，以及确立哪些疾病对表观遗传学蛋白的丢失尤其敏感。比如，使用RNAi筛选发现了急性髓系白血病细胞对BET蛋白Brd4活性的关键依赖性。而新近的CRISPR筛选与RNAi相比，可能提供更低的脱靶效应和更广泛的应用范围。而且，CRISPR筛选可以被设计成靶向特定基因亚群，比如表观遗传学因子。

不过，虽然CRISPR和RNAi筛选可以发现和验证值得关注的靶点，但是针对这些靶点的抑制剂往往不能复制靶点敲除的表型。因为抑制靶点蛋白活性和敲除靶点蛋白表达具有不同的作用机制。这给靶向蛋白降解疗法带来了机会。

靶向蛋白降解疗法是靶向表观遗传学靶点的重要工具

PROTAC蛋白降解疗法利用细胞的泛素-蛋白酶体系统特异性降解靶点蛋白。这类分子通过将靶点蛋白与E3连接酶拉近并形成三元复合体，导致靶点蛋白的泛素化，随后被蛋白酶体识别并降解。过去的研究显示，PROTAC介导的蛋白降解能够复制多个通过遗传学敲除或敲低筛选发现的表观遗传学靶点的表型，而抑制剂往往无法做到。

表观遗传学蛋白往往构成多亚基的复合体，借此对基因组进行特定修饰。在靶向表观遗传学靶点方面，靶向蛋白降解是一种有力的策略，因为针对包含多蛋白域的蛋白，它可以靶向最容易添加泛素的蛋白域，即便这个蛋白域没有活性功能，也可以导致整个蛋白降解。而在靶向多亚基蛋白复合体方面，它可以用于靶向最容易被降解的亚基，而这一亚基的清除可能造成整个复合体的不稳定和降解，靶向蛋白降解剂也可能介导E3连接酶在复合体中的非靶点蛋白上添加泛素链，导致整个复合体的降解。

▲PROTAC介导多亚基复合体降解的方式（图片来源：参考资料[1]）

靶向表观遗传学复合体的PROTAC分子

作者在综述中描述了多款靶向不同表观遗传学复合体的PROTAC分子。名为SWI/SNF的染色质重塑复合体在肿瘤和神经疾病中经常出现突变。针对这一复合体不同亚基，科学家们已经开发出一系列PROTAC分子。其中包括选择性降解BRD9和BRD7的降解剂VZ185，它的发现证明通过不断监测降解剂的细胞降解能力、三元结构的热动力学等特征，系统性的降解剂迭代设计可以开发出高效蛋白降解分子，即使起始分子的降解特征不佳。

开发靶向SMARCA2/4亚基降解剂的研究证明在降解SMARCA2/4的同时，SWI/SNF复合体的其它亚基也同时得到清除。这些研究强调了选择最容易被降解的亚基进行靶向，从而导致整个复合体降解这一开发策略的可行性。

▲靶向SWI/SNF的多种PROTAC分子（图片来源：参考资料[1]）

PRC2复合体是一款组蛋白甲基转移酶，它催化H3K27的甲基化，PRC2复合体近年来受到关注是因为科学家们发现，它的EZH2亚基与癌症进展相关。FDA批准的EZH2抑制剂tazemetostat为靶向EZH2治疗癌症做出了临床验证。

PRC2复合体由4个关键亚基构成，SUZ12，RbAp46，EZH1/2和EED。多款针对这一复合体的蛋白降解剂已经被开发出来，它们都表现出选择性调节特定亚基表达，或者导致所有PRC2亚基降解的能力。其中，靶向EZH2的PROTAC分子E7在实验中不但提高了EZH2的泛素化水平，而且也提高了EED和SUZ12亚基的泛素化水平。这一结果显示，PROTAC分子可以导致复合体中未被靶向的亚基的泛素化，从而引起整个复合体的降解。

PRMT5是一类精氨酸甲基转移酶，在哺乳动物中负责组蛋白底物的甲基化。PRMT5表达的失控与多种预后不良的癌症类型相关，包括肺癌、乳腺癌和肝细胞癌。使用组织特异性敲低实验已经证明了这些癌症类型对PRMT5的依赖性。目前，针对PRMT5的多款小分子抑制剂已经进入临床试验阶段，包括葛兰素史克、杨森和安进的在研疗法。不过，目前的PRMT5抑制剂虽然可以抑制PRMT5的甲基转移酶活性，但是尚没有证据表明它们可以抑制PRMT5的骨架蛋白功能。PROTAC分子可能同时降低PRMT5的骨架蛋白功能，更有效地阻断PRMT5的致癌作用。

▲靶向其它表观遗传学复合体的蛋白降解分子（图片来源：参考资料[1]）

总结与未来展望

综述作者指出，表观遗传学失调和疾病病理发生之间的联系已经得到证实，特别是对预后不良的癌症类型。近年来的遗传学筛选发现了不少特定癌症类型对表观遗传学调节因子的丢失尤其敏感，然而靶向这些靶点的抑制剂却通常不能复制敲除或敲低蛋白的表型。PROTAC技术通过降解靶点蛋白，能够更好地复制CRISPR或RNAi筛选发现的靶点表型。

靶向复合体中的一个亚基造成复合体其它亚基的降解是一个常见的现象。而且，PROTAC分子可以表现出比根据二元结合预期更高的靶向降解选择性，这意味着降解剂可能比抑制剂的选择性更高，从而扩展治疗窗口，提高药物的安全性。

展望未来，作者表示目前研究中发现的PROTAC分子尚未经过广泛的药物化学优化。在PROTAC的生物学机制和靶向表观遗传学靶点的优势已经确认的情况下，作者认为，启动更为广泛的药物化学工作，将是将这一治疗模式转化为临床候选疗法的下一步。

目前，靶向表观遗传学靶点Brd9的PROTAC降解剂CFT8634（C4 Therapeutics）和FHD-609（Foghorn Therapeutics）即将或已经步入临床。作者表示，未来几年里，无疑将有更多PROTAC降解剂靶向更多的表观遗传学靶点。