2024-11-24 06:45:38

做STR的毛细管电泳分析,从峰图可看出为明显的杂合子,异峰出现的原因是什么?

最近在做STR的毛细管电泳分析,研究的为人类AR基因启动子区的“CAG”短串联重复序列。有些地方不明白,希望各大给予指导啊。附图如下:
问题有三:1. 从峰图可看出为明显的杂合子,其中276,282这两个峰应该是目的峰。可是在两个峰之前的比较矮的273,279又是什么峰呢?
2. 这两个小峰是由什么造成的呢?可否采取什么措施避免?
3. 我是要定量276,282的两个峰面积比,而273,279这两个小峰的存在是否会影响我的定量?
谢谢微信截图_20170829161159.png

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1个回答

1. 目的峰的判断无疑是正确的,扩增结果也非常漂亮。在每一个主峰的前方有一个小峰,这个峰的片段大小正好比主峰小一个重复单位(本例中的重复单位为CAG)的长度,即3bp。也就是:276-3=273/282-3=279。这个小一个(有时甚至会出现少2~3个)重复单位的杂峰比主峰低,峰面积也小一些。这些杂峰称为影子峰(stutter peak),在凝胶电泳中则称为影子带/鬼影带(stutter band)。本例中276bp的主峰就分别产生了273bp和270bp等影子峰。影子峰的特点是,随着偏离的程度越大,峰高越矮。

2. 影子峰是由于Taq酶的滑动错配(polymerase slippage)造成的,这是Taq酶的特性(其它的DNA聚合酶也有这个问题),基本上难以通过优化扩增条件加以克服,只能通过经验来判断主峰和影子峰。以前有许多人进行过许多尝试,希望通过改变/优化扩增条件、buffer的配方,以及聚合酶种类的选择等克服影子峰的问题,但总体而言,都不太靠谱。据说网上有一些软件可以帮助判断主峰和影子峰,但对于3碱基重复单元的STR而言,由于影子峰同主峰的峰高差别非常明显,因此很容易通过肉眼就直观地作出判断。

3. 影子峰同主峰(true peak)的峰高/峰面积有比例关系,你可多考察几个实例,求出比例关系即可排除stutter peak对true peak的干扰。

2024-11-24 06:48:28

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