2024-09-11 15:25:19

每次DMEM-F12+血清种板后4小时就这个样子了,这是什么原因呢?

每次DMEM-F12+血清种板后4小时就这个样子了,这是什么原因呢?污染的话也没这么快吧?
以前从来不这样,就最近三四次,换了新实验室,这是我的protocol
1.取孕18天孕鼠断颈处死,( 注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒,防止污染。) 将处死孕鼠的腹部皮肤消毒, 暴露腹腔, 剪下子宫, 立即取出子宫放入冰冷培养液中;胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中;
2.快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中;
3.尽可能的去掉所有的血管和血管膜;
4.夹取皮质,放入含有DMEM-F12的培养基中
5.用眼科剪将皮质块剪碎;
6.0.25%胰酶+0.01%DNA酶消化15min(5min摇动一次);
7. 消化过后可以用1ml血清终止反应;
8.离心 1000转/min,是平的离心机,平角型(这个有关系吗?以前是1000rmp,是角型的)
9.吹打:加入1.5ml培养基和少量DNA酶,缓慢吹打10次,取上清200目细胞过滤,再加入1.5ml培养基和少量DNA酶,吹打10次,共吹打3次。
10.细胞计数,5X104cm2,加入DMEM-F12+10%马血清
11.种板后晃动培养板,平行晃动;
12. 4小时后,轻轻晃动培养皿,吸去培养基,用DMEM-F12洗一次(轻摇晃培养皿),吸去,换neurobasal+b27+谷氨酰胺培养基;
之后每3天半量换液。

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细胞生物学×

6个回答

还是消化和吹打的问题,消化可以试试0.125%的胰酶,吹打力度要适中,可以吹3分钟,再等三分钟,再吹3分钟,养神经元就是这样,关键在于摸索消化和吹打,消化过头、吹打太剧烈神经元容易死,消化不好、吹打不够神经元量太少,得多摸索!还得看运气

2024-09-11 15:26:04

我们实验室用的是neurobasal+b27+谷氨酰胺+抗生素培养基,离心后吹起也是用的这个,你可以试一下  

2024-09-11 15:27:54

感觉神经元消化过度,细胞状态非常不好,建议消化的过程中随时在显微镜下观察状态,可以轻轻吹打

2024-09-11 15:29:44

是消化过度了,24小时新生乳大鼠用胰酶消化,而胎鼠直接机械分离就行,用胰酶消化损伤比较大,这可能与其胶质细胞含量以及细胞外基质少有关。

2024-09-11 15:30:41

明显碎片很多、杂细胞也很多阿!
如果你以前的实验室这么做没有问题,仅仅是离心机换了,那有可能就是这个问题。
我们lab不离心:剪碎并消化15min后,应该有很大团块的悬浮细胞团,我们把这团吸到含血清培养液中,吹打团块10次,一般细胞量都够用了,如果你需要细胞量大 那就把悬液吸出来再加新鲜培养液吹打10次,悬液过筛后计数种板即可,剩下都跟你的方法一样了。至少可以养到10天,甚至2周,方法供你参考了。

2024-09-11 15:33:19

1.排除一下目镜的污渍,用酒精擦干净看看。 2.消化时间和吹打次数减一些。 祝你好运啦。

2024-09-12 07:33:48

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