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2024-09-05 19:37:01
做小鼠stat1和ICAM－1的半定量RT－PCR，怎么老出不来结果？我做小鼠stat1和ICAM－1的半定量RT－PCR，一开始自己设计引物，primer5 评分均为100分，stat-1那对引物第一次P出来了，条带很亮，无杂带，无引物二聚体，但从第二天开始就死活P不出来，ICAM－1还没P出来过，于是重新设计引物，primer5评分仍是很高，仍是死活P不出目的基因。内参倒是次次出现，条带从来都是很亮的。没办法只好用外文提供的引物，仍无结果。于是请同学用他的试剂盒试着P一下第一次P出来过的那对引物，操作也由他来操作，仍是只p出内参，我现在已是黔驴技穷。如有哪位能提供经验证过的相关引物，不胜感激，谢谢！ |
1个回答
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你第一次P出来很亮的条带时有没有做阴性对照(除了不加模板外,其他的都一样)?如果没有做的话,我怀疑你第一次P出来的可能不是目的条带,有可能是污染哦.以致于你后来重新P的时候都P不出来.还有,你用的是不是同一台PCR仪器啊,不同台的PCR仪器有时候P出来的结果是不一样的.目的条带P不出来,除了考虑引物因素外,还要考虑其他的条件(循环数,模板,退火温度,PCR仪等等).你可以再摸摸条件看看,说不定就可以P出来了.注意:按文献上说的循环参数不一定就都P得出来,有时候条件还是要自己摸的.还有,要注意的是RT-PCR是要在冰上操作的 |