2025-03-25 08:05:27

提取总RNA进行RT-PCR,但用试剂盒提了三次,为什么效果都一样不好?

因试验需要从猪胰脏中提取总RNA进行RT-PCR,但用试剂盒提了三次,效果都一样不好。
材料从屠宰场取回约20分钟后,立即采用RNAin(专门用于保存组织样品用于RNA提取的试剂)保存部分样品,另取部分样品置于液氮冷冻保存。然后,分别采用液氮和组织捣碎棒研磨样品,按照上海生工Trizol试剂盒的方法提取RNA。
提取出的RNA样品在普通琼脂糖凝胶跑14分钟(电压较高),只能看到一条很亮的条带,位置于溴酚兰的位置差不多(就像提取质粒DNA时,没加RNA酶处理时,跑在最前面的RNA条带),后面一点拖尾都没有,更别提有18S和28S。咨询公司,说是RNA发生了降解,但降解了总应该有拖尾现象呀。
尽管胰脏和肠组织是RNA酶含量丰富的组织,但我认为各方面都做得很到位却没有合理的结果,不知道问题究竟出在哪里?有经验的帮忙提出解决意见。谢谢!

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4个回答

我认为过程看来没有什么问题,既然是提了三次,那么会不会是试剂盒的问题呀?这是其一;第二,我认为RNA发生降解的可能性也要考虑,或者你用1.0凝胶来再跑一次电泳,不要用普通的浓度;其三,做个对照吧,在取样时候,也提一下其他的组织,这样心理有个数。哈哈,不是高手,只能说说自己的一点经验,仅供参考啊!

2025-03-25 08:06:05

取组织时,动作要快,切成尽量小一点的块,马上用RNAin处理。提取时,研磨过程中要一直保持有液氮,即低温。还有就是你跑胶的条件如何?电泳液要新的,最好有专用的电泳槽跑RNA,要是跟跑质粒的在一起就危险了。Buffer等也最好拿一管新的。

2025-03-25 08:08:02

提RNA的时候要低温提取,用液氮和冰版,而但是组织RNA的降解不是特别的快,组织尽量弄小一点在提会好一点。

2025-03-26 00:56:53

电泳时试试冰浴……低温减少降解,再就是上样量摸一摸条件

2025-03-26 05:16:13

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