用NcoI酶切位点，设计引物除了保护碱基还要多加碱基么？

我构建载体，分子验证是对的，什么都是对的，可就是不表达。这是为什么呢？

求助各位，我都构建了一年多了，总是到这步就卡住了，以前怀疑是自己操作有问题，然后开始测序怀疑模板不对，操作应该还好，我周围同学的分子操作还都是我教的，眼看着人家都一个一个的做出来了，我这个心情。。测序结果模板也是对的，所以现在就怀疑是不是引物的问题，关键是引物还是老师给设计的，各位帮我看看：

我用的载体是pET28A,我的酶切位点分别是NcoI,HindIII,NcoI是他的首个酶切位点。

细胞生物学生物力学

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你的双酶切体系是怎么样的？

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2024-11-28 14:42:36

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很难说的，只要测序对了就行了，不必要纠结这些东西。可能酶切位点被甲基化了，我也遇见过。

你说的不表达是什么意思？质粒在细胞里不表达？可能与载体的启动子有关系，你看看启动子能否在你所用的细胞里表达？

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2024-11-28 16:03:50

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我跟你用一样的酶，可是切表达载体就是切不出来:

我要切的是pNZ8148表达载体，用的也是HindIII和NcoI 可就是切不开，切的不彻底，我也不知道什么原因。

我用的是MBI的酶。我是24ul的质粒，HindIII 2ul NcoI 1ul 缓冲液是3ul,不知道哪错了

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2024-11-28 16:21:51

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ORF对吗？
或者你自己改造下载体，加上一些酶切位点？

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2024-11-28 17:12:34

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