我也是养的原代小胶质细胞，新生鼠取大脑皮层，不要间脑小脑和嗅球，海马好像还留着，感觉这样内层的血管膜更好剥除。一只鼠一个25cm培养瓶，三天后第一次换液，换液早的话容易丢失未贴壁的细胞，之后也是两三天换一次，跟楼主一样，主要看培养基的颜色，变黄的话说明ph改变，就需要更换新的培养基了。

有时候不一定保证铺板均匀，大致差不多就行。细胞长满之后会自动分层，小胶质细胞在上层。以前分离的时候单纯用摇床120转/min，40min。但是我们摇床不好，就算两瓶合成一瓶提纯，得到的细胞数很少。这次在摇完之后我又用手拍击培养瓶底，两瓶并在一起，各拍两百下，注意培养瓶边缘的位置也要照顾到。然后镜下观察大部分的小胶质细胞都已经游离之后，收集上清后离心、重悬、铺板。我做的都是两瓶细胞合并提纯后共培养，为了提高细胞密度。

其中有分叉的应该就是静息状态下的小胶质细胞，圆形的应该还是因为离心而被激活的小胶质细胞。如果不着急的话多培养几天，等恢复静息状态的时候再做实验应该对比比较明显，但提纯后的小胶质细胞还能养多久才死亡我也不太清楚。而且回来我要把细胞种在6孔板后再用凝血酶激活，所以还不清楚激活后小胶质细胞的形态。

难道是你加LPS处理前有没有换空培饥饿？

我们大鼠原代培养都不加双抗的，而且100ng/ml的lps足够激活小胶质细胞