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2025-01-15 10:39:54
空载体转化实验和Control对照没问题，但就是表达载体转化后不长菌落，试过很多比例，现在没法后续？现在正在做pGEX-4T-1的表达载体的构建，双酶切后割胶回收，再16度过夜连接，转化DH5 alpha感受态细胞，37度过夜培养，平板上很干净，一个菌落都没长。做过空载体转化实验和Control对照实验，感受态细胞和连接酶都没有问题。限制性内切酶用的是Fermentas家的FastDigst BamH I和Sal I,连接酶用的是宝生物的Vector pMD18-T试剂盒里的Solution I。 连接比例做过1：3，1：4，1：5，1：9，都没有长菌。目前实验无法往下进行。 请各位看看，我的实验哪出了问题？需如何改进？ |
4个回答
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基因和载体的浓度够吗？适当提高浓度看看，如果浓度太低可以用真空机吸一些水分出来提高浓度，希望有用。 |
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为什么用T载体试剂盒里的solution I 呢？一般做T-A克隆时才用的啊，连接时用的酶是T4连接酶，你换个酶试试看呢？ |
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你的连接片段是PCR产物还是做的亚克隆？PCR产物的酶切效果没亚克隆好，我以前做的连接和你基本一样，就是载体不一样，酶用的是宝生物的两种酶 |
