2025-04-06 22:25:12

如何做质粒转染?

课题方向想做某基因对上皮间质转化的影响
初步设想是做基因敲除,看细胞形态,相关分子表达情况,细胞侵袭实验
目前处于细胞培养阶段,选的是MDA-MB-231 细胞 ,但是对基因敲除的手段不是太了解,师姐建议用质粒转染的方法。因为对该项实验技术完全不了解,所以想求教一下!!
质粒转染需要做好哪些前期准备,如何建立细胞系,在质粒的选择和转染试剂的选择上有什么好的建议,还有就是麻烦大神们可否指导我一下,怎样做这个质粒转染!! 万分感谢!!


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细胞生物学×

4个回答

如果确定要做质粒转染。那么首先要有质粒,然后才能转染。
所以第一步就是做质粒:然后继续分解:1.要对质粒有了解,简单的说质粒是一个载体,可以携带目的基因进入细胞;2.你要携带什么基因,根据你的描述,你要携带的是干扰基因,该基因能翻译成RNA后,可以干扰你的目的蛋白翻译,从而起到基因沉默的作用;3.干扰基因的序列是什么,这需要你自己查资料自己设计或者找公司设计;3.一般的质粒是我们成为空载,即没有携带目的基因。那么问题就来了,如何让空载带上干扰基因,也就是所谓的做干扰质粒。可以找公司,也可以自己做。4.如何让做好的质粒进入细胞发挥作用:这个过程叫做转染。转染的方法很多,常用的是脂质体转染,多用Life公司的Lipo 2000(现在已经有lipo3000了,据说效果比2000提高了快10倍),这个最方便,属于瞬时转染,,具体方法有说明书;也有用电转的,这个需要特殊的电转设备,比较麻烦,但是转染率高,相应的转染条件也高。4.转染之后第一步要确定干扰效果,可以问你师姐如何解决。5.摸索好条件以后,就可以进行你后续的什么看细胞形态,相关分子表达情况,细胞侵袭等试验了。6.从楼主的语言描述,感觉对质粒构建不是很熟悉,推荐直接找公司构建,当然,如果作为学习,自己也可以构建,但是要有多次失败,时间超长的心理准备。7.如果转染效率不好,推荐病毒包装即用病毒作为载体,楼主可以看一下载体的一些知识。
对于:质粒转染需要做好哪些前期准备,如何建立细胞系,在质粒的选择和转染试剂的选择上.细胞系也要根据自己的实验需要,楼主已经选好细胞系了。至于质粒选择,也是要根据你的实验设计,比如你需要这个质粒具有抗某些药物的特点,以便于后期细胞筛选等等,这些都可以和公司商量。


2025-04-06 22:27:00

做稳转的话慢病毒大概2周搞定。质粒顺利的话两个月。我选了后者,运气不好,做得死去活来的,过年还不能安生。当然如果顺利的话就不会跟我一样啦。首先细胞要耐得住折腾,然后瞬转的效率要越高越好(做western检测),然后这批细胞尽量两个月不要污染。。。其实我也还没做出来。做不做得出来要到两三个月后跑个western才知道。慢病毒的话,转染后就有7,80的转染率,基本上不要筛选,直接进入下一步实验。这也是价格昂贵的原因。

2025-04-06 22:32:55

如果实验室慢病毒载体构建和慢病毒包装(这个可以找公司做,但是费用较高,顺利的话也要1万,但是省时省力),慢病毒转染(这个比较麻烦的,利用小RNA阻断基因表达),以及后续转染后阻断效果的验证技术部成熟的话,可以考虑应用药物阻断,有许多基因都是可以用药物阻断的,如果已是成熟的理论,那你就省事多了,直接进行后续实验。建议考虑。

2025-04-06 22:35:28

提取质粒后,去内毒素;购买转染试剂,我们用lipo2000转染试剂比较多,按照转染试剂说明书进行转染体系优化

2025-04-06 22:37:49

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