测定蛋白质三维结构的方法主要有X射线晶体衍射分析，电镜三维重构技术以及核磁共振技术。

X射线晶体衍射分析（X－ray Crystallography）主要包括以下几个步骤：

1． 晶体培养。结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。

2． 数据收集和处理。一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，在经过专门的数据处理程序包处理，给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的好坏。

3． 测定相位。用 X 射线衍射方法测定晶体结构，其核心问题是解决每个衍射点的相位问题。对小分子可以利用 Patterson 函数计算出晶胞中原子的位置，但是大分子不可能利用这种方法，只能利用其他方法如同晶置换法才能确定相位。

4． 相位的改进。电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。在某些情况下采用晶胞不对称单元中等同部分的电子密度平均，有可能大大改善误差较大的起始相角。

5． 电子密度图的计算和解释。有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。由于蛋白质分子结构的复杂性，它的电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识别出的结构层次也不同。

6． 结构模型修正。从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精华。

核磁共振主要步骤如下：

先准备样品，浓缩蛋白质的水溶液（0.21－1mM），如果测1H谱需用D代试剂，将样品置于外加磁场中，测量共振频率，计算机通过频率得出每一对原子核的偶合常数和NOE值，计算对应的原子间距离。最后构建模型。

三维电镜方法的主要原理是中心截面定理：

二维投影（电镜照片）的傅立叶变换＝物体的三维傅立叶变换的一个中央截面

X 射线晶体衍射分析就是用于测定晶体的结构，核磁共振除了测定分子结构之外还有很多方面的应用。例如研究脂的多型性，离子浓度测定（如细胞内 Na＋的测定），活体中磷代谢的研究，核磁成像（恒定磁场加梯度磁场）等。三维电镜方法主要分为三种手段：电子晶体学，单颗粒技术和电子断层成像技术。在电镜下观察生物大分子时，观察的对象是三维结构，电镜图像是这些三维结构的二维投影。三维电镜技术不需要结晶，没有相位问题，最新发展的冷冻制样技术使样品更好的保持在生理状态，且没有分子量限制，甚至细胞也可以进行三维重构。:

同源模建，晶体衍射，冷冻电镜