自噬流（autophagy Flux)怎么检测?

请问你们是怎样检测细胞内的自噬流（autophagy Flux)？我检测了细胞内LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin 1的表达，可是杂志要求再检测自噬流，我想问问自噬流该用什么方法检测呢？

细胞生物学

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1.检测LC3II/LCI: lc3参与自噬的形成，自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，LC3II升高代表自噬的启动；2.检测P62：P62可以通过自噬来降解，因此P62可以反映自噬的强弱。当LC3 II升高，P62同时降低，表明自噬流通畅；如果LC3II 升高，P62升高，表明自噬起始正常，但下游不通，吞噬体和溶酶体不能融合。3.除此之外，当自噬减退，如何鉴别其发生在自噬形成阶段OR自噬降解障碍呢？可以通过RFP-GFP-LC3双标腺病毒检测。GFP在酸性环境中降解，红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体。如吞噬体和溶酶体能正常融合，那么红色荧光多于黄色荧光，如自噬下游阻滞，吞噬体和溶酶体不能正常融合，则主要为黄色荧光。

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2017-04-13 08:29:53

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我看的文献是这样的：1.构建红绿荧光（RFP-GFP-LC3）转基因的小鼠2.加溶酶体抑制剂bafilomycin A，阻断自噬体和溶酶体的结合，westernblot检测LC3-II的水平

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2017-04-13 08:30:43

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具体自噬流的检测可以参考这篇文献。Defective Regulation of Autophagy upon Leucine Deprivation Reveals a Targetable Liability of Human Melanoma Cells In Vitro and In Vivo. Sheen JH, Zoncu R, Kim D, Sabatini DM. Cancer Cell. 2011 May 17. 19(5):613-28.10.1016/j.ccr.2011.03.012 PubMed 21575862

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2017-04-13 08:31:54