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2017-10-15 05:33:07
Western Blot始终跑不出理想的Actin和AKT条带，是什么原因1.本人原代提取的牛肺动脉内皮细胞（PAECs）及肺动脉平滑肌（PASMCs）细胞用于实验，分时间段对细胞进行炎症模型的建立（阴性，4h，8h，12h，24h，48h），造模后提取蛋白。2.蛋白提取：直径60mm的培养皿，裂解液（RIPA:PMSF=100:1）50μl/皿，超声裂解，离心（4℃，12000g，15min），-80℃保存。BCA法测蛋白浓度，酶标仪检测各蛋白OD值，计算蛋白浓度，50μg上样量用于跑western。 3.片段大小：actin 45KDa， AKT 60KDa4.配胶：10%分离胶（凝30min左右），5%浓缩胶（凝10min左右），保鲜膜包裹，4℃，次日使用。 5.跑电泳时刚开始60U，待marker分开始调整至120U,转膜恒流230mA，2h左右，丽春红染色，TBST洗净后封闭2h（5%脱脂奶粉，TBST配制）。 6.抗体：一抗CST的β-Actin Rabbit mAb，1：1000稀释，4℃过夜，说明书 Species Cross-Reactivity中有Bovine这一项，跟我的应该是匹配的。次日室温孵育1h，TBST洗3遍，孵育二抗。 二抗G-a-R（H+L），1:5000稀释，2h。一抗，二抗前后都用TBST洗3次，10min/次。7.曝光：我们科里有专门的机器，发光液前几次用的BeyoECL Star A液和B液，最近几次用了万类生物的ECL超敏发光液。 下面这些是我的实验结果，尤其AKT条带实在不尽人意，我很注意每个细节，真心不知道哪个环节出问题了，所以很苦恼。
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7个回答
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我们实验室在跑WB过程中也会出现这样的条带，我自己觉得原因如下： 1.在上样过程中上样孔内有异物，没有提前冲上样孔，导致曝光后条带出现深浅不均匀的情况。2.发光液没有滴加均匀，可以将膜放在封口膜上，滴加发光液使其均匀分布在膜上再进行曝光。总结：个人出现这样的原因与上样关系密切。 |
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除了Fig。2 其它5张图的内参（actin）并不能显示你的上样量是均一的（这和你事实上样量是否一致没有关系，用最终结果说话），提示你的实验体系并不是很ok，建议先优化内参，等内参一致提示你实验体系ok了，再说你测的Akt的事情。WB步骤前后多大二十几步，确实不好控制。 |
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1.由同一盘或一瓶细胞分到对照组和实验组，最好是不同时间点处理，同时收细胞。2.若排除蛋白定量不准以及操作因素之后，考虑actin的表达会受到实验处理的影响，建议换种内参试试。3.上面两点做好之后，若AKT依然不整齐，考虑AKT总蛋白的表达可能受到实验处理因素的影响。 |
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这其中部分蛋白是查缺补漏的，就是哪个时间段的没了，我就重新提取用于实验的。”这样做是极其不好的。你可以试试，再重新提取一个还有的，相同时间段，不同批次提取的，看表达是否一样。 |
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我们实验室在跑WB过程中也会出现这样的条带，我自己觉得原因如下：1.在上样过程中上样孔内有异物，没有提前冲上样孔，导致曝光后条带出现深浅不均匀的情况。2.发光液没有滴加均匀，可以将膜放在封口膜上，滴加发光液使其均匀分布在膜上再进行曝光。总结：个人出现这样的原因与上样关系密切。 |
