看了下你的情况，我有几个问题1）为什么选用BamH1和EcoR1两个酶切位点？从pcDNA3.1+载体图谱上看，这两个酶切位点相隔太近，你用双酶切载体制备vector的时候，如何确保两个位点的酶切充分完全？我的建议是，如果不想换酶切位点，线性化载体的时候就采用单酶切的方法，先切EcoRI，取少量产物跑胶确定已经线性化，再切BamHI，胶回收酶切产物。另外，如果时间和经济允许，目的片段序列也允许，建议换用HindIII+XhoI这两个酶切位点，NEB的这两个酶是可以双酶切的，我用这两个位点已经构建了几十个constructs了，屡试不爽。2）是否有设置自连对照？这个问题实际上是上一个问题的延续，本质上就是检测载体双酶切的效率如何，根据自连对照克隆生长情况，还可以大致推断整个连接系统是否有效，以及感受态的效率如何。不知道你有否设置自连对照。如果有，那么自连对照的克隆生长情况如何？有没有提质粒跑胶看看片段大小？
3）我从来不用PCR来鉴定克隆。这个也跟个人喜好有关吧，我总觉得这种方法太容易产生cross contamination。我比较喜欢用in gel screening这个方法，省事省时，而且很直观。4）最后友情提示一下，凡是构建constructs的所有电泳和胶回收操作，一定要使用新鲜的TAE buffer,而且一定要用新鲜的双蒸水配制。4kb的insert虽然有点大，但是难度还不是最大。 

要先确定你那么长的片段当中不含有这两个酶的酶切位点。但一直在1000 bp左右出现较弱条带，应该是非特异条带。还有就是酶切产物最好都进行电泳后回收，以免载体切下的片段又连回载体上，降低了成功率。如果实在不行的话，考虑ＴＡ克隆。 

BamHI、EcoRI可以的，我做过。
载体和片段都是胶回收的？在回收片段纯度没有问题下考虑以下因素1、 克隆长得少可能表示载体酶切尚可，很可能片段酶切得不好。合成的引物是否完整？上面的酶切位点是否正确？如果时间允许，克隆到T载体上再酶切。很多PCR产物酶切连接不上的问题克隆到载体上后再酶切都没有问题了。2、片段测过序吗？内部是否有这两个酶？ 

TA克隆的确是长片段亚克隆的好的手段。我最初开始学习构建质粒的时候也是先上TA，不过我们实验室一直使用一种KAPA HIFI readymix的酶，效果很好，保真性也非常非常高，就是做TA的时候比较麻烦，需要把PCR产物纯化回收后再加一次A tail，而就是这一步我感觉一直没有摸索到最优化稳定的条件，所以每次加A后连pCR2.1
转化的结果都不稳定，有时候长的多有时候长得少，有反应这一步其实很简单，没什么很难得因素。但是不管怎样，我现在对长片段的TA克隆是有心理阴影了，所以我一般都是直接设计带酶切位点的PCR引物，扩增出目的片段后直接酶切再连目的载体，至今还没有做不出来的。
再次祝你好运，有进展记得与大家分享。 

 4KB的PCR产物片段直接双酶切克隆，要靠运气了。强烈建议TA克隆，测序OK后，再换载体，这样的话成功率才会高。
需要确认几点：1，PCR产物两端的酶切位点在不在；2，筛选阳性克隆时，不管是菌落PCR还是质粒酶切，由于片段与太大，都不好去判断。建议：如果是PCR鉴定，则可以在中间设计一条引物，与目的载体的一条通用引物进行配对，扩增出来的大小为1k左右，这样便于判断。如果采取酶切方法鉴定，建议在片段中选取内切酶，只要切出来的大小符合我们理论上的要求即可；3，克隆时阴性对照非常重要。
希望对你有帮助 

长片段的酶切和连接是难点，某种程度是靠运气的。建议先做TA克隆，这样片段酶切的成功率回增加。