WB的结果只能在同一次曝光中对同一张膜上的同一个蛋白上进行比较。

同一个蛋白：不同蛋白是绝对无法用WB的结果来比较表达量的，这个的根本原因在于不同抗体结合效率是不同的，因A抗体对其抗原结合能力定义为1000，而B抗体对其抗原结合力可能只有10，那么假定A和B都表达量都为X，实际比值为1，但WB的定量是看的曝光强度，这个取决于有多少抗体结合上去了，那么反应出来的A的表达是B的100倍，因此不同蛋白是不会用于相互比较的，只能表同一个蛋白在不同标本中的不同，由于所有检测目标的和抗体亲和力是一样的，决定定量结果的只是标本中目的蛋白的含量了。切记WB的原理和real-time PCR是完全不同的，WB无法进行绝对定量，因此无法对不同目的标本进行比较。

同一次曝光：所谓WB的定量是看的曝光强度，而曝光强度除了和膜上目的蛋白的量有关系以外，还和曝光时间有关系，因此不同曝光获得的结果是没有可比性的，当然，如果用内参比一下，似乎可以说明问题，但是这个实在不是令人信服的做法，在发表文章时应该会被严重挑剔。。

同一张膜：显然，转膜效率不是百分百，没人能保证两次转膜效率是一致的，这就从根本上否定了比较两张膜上蛋白表达量的可能，同样，用内参比也不是个好方法。