一点个人意见，请参考。药物为苯环的羧酸酯类结构，因而很容易发生酯酶的水解反应，因此原型药物含量会低，而会有代谢产物出现。因此我怀疑是否有其它代谢物生成，而不是因为什么共价键结合。一般情况下，沉蛋白，液液萃取，固相萃取等方法至少有一种方法能获得良好结果，除非吸附和分子状态问题。

提供点建议仅供参考:我做的药也有你描述的这种情况,现在是采用衍生化的方法解决的,通过测定反应产物进行药动参数的测定,有文献报道与我的药结构类似的化合物能与蛋白共价结合.你现在还不确定的话,可以试试各种酶,如胃蛋白酶,胰蛋白酶,枯草杆菌酶,葡萄糖醛酸酶等。

我的一点想法：剩下未提取出的50%有可能含水解物，但不一定全是，有可能还有一小部分原型药和蛋白结合的。根据FDA的生物样品分析方法的有关规定，现在对回收率没有严格要求，只要能满足你分析的要求，检测限，灵敏度等能达到要求就可以了。

用乙酸乙酯能测到，为什么要换成乙腈沉淀蛋白的方法呢？你预试验测回收率的浓度是多大？同位素标记你的原药进行试验才能证明你的药是否和蛋白共价结合。我用的衍生化的方法，测定的是原形药和衍生化试剂反应的产物。分析分析你的原药的结构，再考虑考虑能不能用别的方法，提高检测灵敏度，试试荧光，质谱检测，查查相关结构化合物体内检测的文献。