2024-11-17 13:24:57

免疫沉淀下来的复合物究竟是什么?

通过抗体和protein A-agarose免疫沉淀下来的复合物究竟含有那些成分?我想当然应该是抗体、抗体结合的抗原以及protein A-agarose,但是后面作 western是又是用的另外的抗体作的,这我就有些搞不懂。比如 IP用FAK, IB用FAK or PFAK这个好理解,可以反应FAK 与PFAK的差别,但是如果IP:PY20, IB:FAK or pFAK ,和IP:P85, IB:FAK or pFAK,我想沉淀下来的应该是PY20和P85, 为什么要用不同的抗体作IP?又如IP: P85 IB: FAK 与IP :FAK IB : P85结果有什么区别?

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生命科学× 免疫学×

2个回答

我们平时用来做IP的一般都是专一性较强的抗体,一般只针对某一种抗原,沉淀下来的就是含有这种抗原蛋白的复合物。

2024-11-17 16:10:04

你的疑问主要出在对免疫沉淀和免疫共沉淀的理解上,免疫共沉淀的目的是检测蛋白质的相互作用。我们来看看你举的例子:IP用FAK, IB用FAK or pFAK:这是个免疫沉淀的例子。这里IB检测的pFAK是IP沉淀的FAK的一部分,IP的目的是提纯总FAK,IB的目的是检测其中的pFAK。这个实验的目的仅仅是增加蛋白的丰度;试想,如果目的蛋白丰度很高,我们可以忽略这一步而直接提取总蛋白做western-blot。然而免疫共沉淀的目的则不同,它不是为了提纯蛋白,而是为了检测蛋白的相互作用。假设我们怀疑蛋白A和B在细胞中有相互作用,即形成复合物,那么我们就可以用A的抗体来做IP,然后用B的抗体来IB检测,如果检测到蛋白B,那么就可以证明A-B复合物的存在。这里沉淀下来的是两种或多种蛋白,因此叫免疫共沉淀。你所举的例子:
IP:PY20, IB:FAK or pFAK——验证PY20和FAK、pFAK是否有相互作用;
IP:P85, IB:FAK or pFAK——验证P85和FAK、pFAK是否有相互作用。
关于你的最后一个问题:IP: P85 IB: FAK 与IP :FAK IB : P85结果是否有区别?
这两种方法都是为了证明p85和FAK的相互作用,因此理论上是没有区别的。然而,在实践中我们往往会考虑一些实际的因素。由于做IP所用的抗体浓度远远高于IB的抗体浓度,因此,我们一般将抗体较廉价的那个蛋白做IP,较贵的做IB。

2024-11-17 16:16:12

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