关于HPLC用于重组蛋白药的纯度检测方法学

想请教大家一个关于HPLC方法学的问题。

目前我们做的一个蛋白药，没有标准品，液相建立一个方法只想用于纯度鉴定，不去定量，这个方法所得到的图谱就一个主蛋白峰，面积归一化法相当于100%，现在就这个方法的方法学验证提出下面几点疑问：

1.因为我只做纯度鉴定，这个方法的方法学应该做系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这些，还是按照定量的全套加上定量限、线性、范围、准确度这些？

2.纯度鉴定中，我觉得应该对杂质进行定量，但是我们的这个方法只有一个主蛋白峰，几乎没有杂质峰，这样的话这个方法学我应该以什么为标准证明纯度呢？需将样品进行适当的氧化、酸、碱破坏吗？然后证明破坏后主峰能和产生的杂质分开？

3.对应生物蛋白药的杂质，应该属于无法获得的，如果通过强破坏，这个杂质也是不好鉴定的，是不是我只需要知道主峰能和强破坏的降解物分开，就可以说方法建立成功？还是生物药没有必要做这个强破坏，简单的走一下系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这样的流程就行？

说的有点乱，主要是自己对这个生物药的HPLC纯度鉴定的方法学，实在是疑惑重重，希望有经验的朋友能帮忙解答下。非常感谢！

生物制药药物化学

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1、虽然说你是为了纯度鉴定，实则是做杂质检查。按规定有两小类，你的质量标准应该是主峰大于多少，而某个杂质的值小于多少，则可以归为限度检查，那么按照验证技术审评一般原则只需做耐用性，专属性，检测限度。

2、100%其实让人很质疑，是不是你的方法根本没把杂质分开。建议通过各类处理也好，还是表达一些杂质，如聚体碎片，或找一些与可能杂质分子量类似的其他物质代替，去检测你的方法分离度等问题。

没实际经验，个人理解，抛砖引玉，仅供参考

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2024-09-05 15:06:14

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目前我接触的HPLC纯度项是SEC，算法也是面积归一化法，希望能给你一些启发。

1、SEC是作为纯度项，检测单抗或融合蛋白的单体纯度和聚体比例。目前的验证思路是借鉴了部分化药的思路，包括系统适用性、专属性（包括破坏的样品和未破坏的样品）、线性、准确度、耐用性、精密度。其实个人认为线性没有必要做，因为算法中不涉及峰面积和蛋白含量的直接关联。

2、杂质的话，是通过强制破坏的方式来增加体现的。处理方法很多，主要是氧化或者光照。然后证明该杂质不影响单体正常出峰，主要是单体的出峰时间。

3、方法建立是否成功还是要看实验目的，SEC的目的是将单体和聚体分开，所以只要二者分离度达到一个标准，就可认为方法建立成功。最终还是看该项实验是为了鉴别还是纯度测定，如果楼主只是为了鉴别，可以参照药典里的鉴别项验证方法。

以上仅是个人接触的一些项目经验，有不妥之处还望包涵。

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2024-09-05 15:15:39

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