想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。
设计没有问题。大胆做就可以了。 几点建议： 1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能 2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点 3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。 因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。 （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）
除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。 另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！
