提取过程中要避免RNA和蛋白的降解。

转染细胞24小时后可以检测到荧光表达，粗略计算了一下转染率，大约10-20%左右；太低了吧 你自己想下 你提的mRNA和蛋白中 阳性的占多大比例？我怀疑你根本没提出阳性的

 真的有可能是表达量过低，检测不出。

如果有10-20%的转染效率，应该是可以检测出来的，PCR和western的灵敏度还是很高的。不过在实验中有没有加入相应的阳性对照呢（比如单独转染PEGFP载体的）？建议重复一下看看结果吧。

你用GFP的抗体做一下western，有的时候可能表达的是GFP单体蛋白，而不是融合蛋白。另外，你无需提取mRNA进行检测，因为你的基因是否有poly A都是未知之数，所以反转录可能不一定能得到你的目的cDNA

 前面说“将转染后的细胞提取RNA和蛋白分别作PCR和Western检测，未见有融合蛋白的mRNA和蛋白表达，”——认为你这里用的是目的蛋白的引物和抗体；
后面说“做了一下EGFP的western，发现在融合蛋白和EGFP单体的位置均出现条带”，那么至少说明一个问题，EGFP正确表达了（对应了你说的观测到荧光），并且EGFP和你的蛋白一起表达了。至于出现单体，很正常，只是蛋白裂解而已。
综合两个实验结果来看，有两个可能：
第一，是第一次实验的结果是可信的，即PCR和Western确实没有检测到你的目的蛋白，那么说明你连接进质粒的这段基因有问题。但是你说过你的引物是测过序列的是正确的。因此基本可以排除这个情况了。
第二，或者是你的第一次实验结果不可信，你的目的蛋白表达了，但提取mRNA失败了？反转录失败了？PCR引物拿错了？蛋白抗体坏了（这个也是比较可能的情况）？——所以PCR和Western没有结果。
建议换个公司买你的目标蛋白的抗体试试western。

转染效率太低了，貌似这个载体是个满病毒载体，考虑包装病毒颗粒。或者再293t细胞检测你的重组载体的表达效率，确定没问题后，再转到你实验细胞中继续