你可以先低氧处理细胞，用real time PCR或Western检测你的基因是否上调。如果真的上调，接下来再做荧光素酶分析，如果分析有变化，再做点突变，或EMSA，ChIP等。如果real time PCR或Western没有变化，就没有必要接着往下做了，因为有些时候，荧光素酶分析有变化，real time PCR或Western不一定有变化。荧光素酶分析不完全等同于体内，毕竟是克隆出来的载体，一些染色体调控，如组蛋白等的调控，不同于体内。单单一个荧光素酶分析说明不了问题。

这个就真的很难说了！不过你把这段序列连上去的话也应该是一段不短的序列，所以你后面做的也就是研究一下转录调控了，看看还有没有其他的可能转录因子影响此蛋白的调控。再说了，构建一个质粒做个预实验不算是麻烦的事了吧，你好像有点苛刻自己了，做的东西都必须要有用的。

可以用低氧转录因子的载体共转染，检测luciferase活性

可以用怀疑结合的区域序列设计probe，做EMSA的抗体竞争实验，验证一下是否有结合。