我最近做RT-PCR出现了怪问题,发现同一引物扩增出的扩增曲线的扩增效率不同,出现了如图所示的情况,请各位指点迷津啊!谢谢。 (共3个目的基因,1-7是内参,8-15是目的基因1 ,16-23是目的基因2。有四个样本,每样本做两个复孔。扩增曲线及溶解曲线如图)
以我个人观点: 1 加样误差比较大;
2 复孔最好三个以上;
3 部分引物需要重新设计。看溶解曲线最后的那个峰值,尽管你的引物最后的峰值都不很尖,但基本上峰值与基线的距离比较大就可以了。基本上在扩增过程中没有出现S形曲线的引物可能都要换掉。
4 模板可能不好,因为你的内参与靶基因的CT值几近相等。一般来讲。内参的CT值应该在10以上到20左右,比靶基因要低。
结果很好。可用的。你说的杂乱是所有引物混在一起了,如果你只看其中的一个基因,就好多了。出现在75度是有点低,不过可能是由于引物的TM值较低的原因。重要是的尖峰非常漂亮;起点不同说明其起始模板浓度不一样,所以很正常。重要的是S形曲线平滑就好。