2024-12-23 16:05:57

做western blot前必须要建立在有关基因的PCR的结果上吗?

请问在做western blot前必须要建立在有关基因的PCR的结果上吗?想做Akt, P70s6k等几个磷酸化蛋白,但是好像没有磷酸化的引物啊。


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4个回答

我觉得没有必要,如果要检测蛋白的变化还是以wb为主,pcr为辅,毕竟wb反应的结果是实实在在的蛋白的含量,而PCR只是反应mRNA的量,


2024-12-23 16:25:05

我觉得还是有必要的,比较抗体还是比较贵的,PCR相对便宜很多。在不确定实验结果的基础上,有些boss不一定会同意买抗体的来做western-blot的。
不过前面说的也对,PCR结果与WB的结果不一定完全匹配的,比较一个是基因水平,一个是蛋白水平。不过楼主要检测磷酸化的话,就和PCR没有什么关系了。因为PCR只能通过转录水平的变化来间接推测蛋白翻译水平的变化,而对翻译后的修饰(磷酸化)是没有指导作用的。所以楼主是找不到磷酸化的引物的,因为磷酸化不是基因水平带来的,是蛋白质后期修饰带来的。如果要做PCR,普通的引物就可以了。


2024-12-23 16:29:12

个人觉得没有必要,我觉得蛋白的表达变化不是最主要的,尤其对于这些磷酸化蛋白,其活性才是重要的结果,翻译后的修饰(磷酸化,乙酰化。。。),所以还是直接WB吧


2024-12-23 16:32:32

做蛋白的磷酸化 可以观察WT结果中条带是否有shift 以PPase处理为对照


2024-12-23 16:34:59

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