用重叠延伸PCR技术的方法怎么也连接不起来两个片段，怎么办？

请问各位高手，我需要将1000多和2000多的两个片段连接起来，用重叠延伸PCR技术的方法怎么也连接不起来？（重叠碱基23个）总是扩增出1000多的杂带，没3000多的目的片段，原因可能是什么？希望大家给予指点！谢谢！

细胞生物学

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23bp我觉得确实还是有些勉强，尤其你的片段长，如果能排除别的问题，增加几个碱基更好啊

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2017-02-26 21:23:19

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首先，把1000多和2000多的两个片段变性后（如果能分离出单链，可能效果更好），不加两端引物进行PCR然后，再加1000多的上游引物和2000多的下游引物进行PCR（第一次那产物可能不需要太多，杂质多了PCR影响大。由于PCR指数扩增，模板量少在这里不是问题）当然，你用的所有试剂要有保证，比如要高保真的要扩增效率高的酶，一般的Taq酶work不了的...另外，重叠区23bp的Tm与退火温度要相应调整，如果能加长一点可能更好...每一个具体的实验，可能具体参数会有不同...

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2017-02-26 21:26:41