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酵母质粒提取： 1. 单菌落到5ml液体培养基中，30度，230rmp，振荡培养24h， 2. 室温，1000g，离心5min，收集细胞，加入200ul酵母裂解液200ul酸洗玻璃珠，在此加入200ul苯酚/氯仿/已戊醇（25:24:1）注明：先加入氯仿，在加入玻璃珠， 3. 剧烈振荡5min， 4. 室温，12000rmp。离心5min， 5. 取上情于另一个EP管中，加入0.1倍体积的NAAC（ph5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，冰上冷却15min，离心15min，去上情， 6. 用水配置70% 酒精，真空干燥， 7. 裂解夜2% triton100，1%SDS(1Gsds加入80ml水，然后68度組溶解，0.1M Nacl，10mM tris hcl ph8，1Mm edta，玻璃珠用浓硝酸洗涤1H，再用水洗至PH为5-6，干燥使用前，冰上冷却，用水量好刻度，倒掉水， 酵母DNA的提取， 1. x新鲜的菌体中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。 2. 离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul， 3. 加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。 4. 加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）， 5. 12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）， 6. 12000rmp，15min，弃上清。 7. 150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min， 8. 将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min， 9. 加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中， 10. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提， 11. bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA， 12. bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA， 13. bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA， 14. 筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法， 酵母菌落PCR， 1. 酵母质粒和基因组DNAPCR模版的制备：取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取1ul用于PCR； 2. 从平板上调取长势良好的菌落少许，悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子因受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min； 3. 利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落，至于EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR， 真菌DNA的提取方法改良； 1. 酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌体， 2. 取少许新鲜的菌体，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蜗牛酶（30mg/ml），37度温浴60min， 3. 3000r/min离心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。 4. 加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分钟， 5. 10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）在5000-6000r/min离心15s， 6. 沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，离心15min； 7. 上清液转移一个干净的离心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min； 8. 加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中； 9. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提 后续试验思路： 1. 提取酵母DNA； 2. 作PCR； 3. 筛库的引物（上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC下：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT；因为这个引物的TM值很高，所以必须使用二次PCR；94度，3min，95度，20miao，68度3min，68度7min，15度15min；修改程序94度，3min，95度，25miao，50度25miao，72度1min30s，72度5min； 4. 利用T和B酶切（65度酶切）；Taq I（AGCT） ；10*Taq I Basal buffer ；0.1%bsa ；PCR产物 ；灭菌水 ：酶 BsuRI(GGCC) ；；R buffer ；模版 ；灭菌水 ； 5. 分出不同的片断；. 将DNA转到大肠杆菌中，然后提取质粒，测序或是使用抗生素筛选AMP，得到AD，kana得到BD，己的程序试一试把 |
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可以用lyticase，我用的tiangen的，3000个单位的包装才150元。我是提RNA，根据promega sv total rna isolation 里要求的破壁方法，1、将适量酵母于合适培养基、合适温度培养过夜，第二天，将培养物用同样培养基按1：50稀释后继续培养，直到OD600达到0.6-1.0，这一般需要短短几小时。（酵母数小于4*10^7方），、14000g离心2min。3、将离心得到的沉淀溶解于100ul溶液（高压灭菌即可）中：组成：1M 山梨醇，1M EDTA(Ph 7.4)，使用前加入0.1%巯基乙醇和50个单位的lyticase。(0.1%是体积比，、在30℃孵育15-30min直到溶液变为澄清。(我的是20分钟镜检大约90%都已经变成圆球状了)，果还是不错的，你可以试试啊，如果不行的话可以考虑加大lyticase的量或者孵育时间。 |
