2024-12-22 17:17:16
提取足够量的蛋白需要多少细胞?想从HeLa细胞里提线粒体蛋白,然后做双向分析差异。收取80个10cm直径平皿培养的细胞,匀浆至70%细胞typan blue阳性,差速离心后取粗提物再进行蔗糖/percoll不连续梯度离心,收取30%~60%之间的组分,但是所得线粒体很少很少,在10ml离心管里只能看到很薄的一层。收集到的组分经过洗涤后更加所剩无几。之前用小鼠肝脏进行预实验提取线粒体时,一只小鼠的肝脏所得线粒体蛋白量还是比较大的。现在不知道是从HeLa里提取线粒体所得蛋白量本来就很少还是我的protocol有问题。希望有达人指教,如果是前者,我就只能再加大细胞的量了。如果是后者,希望有相关经验的大大能指点一下迷津。 |
我以前也做过线粒体的样品,感觉提取出来的蛋白很少很少,后来就先裂解细胞,裂解液不能多。先在一个盘上涂300ul的裂解液,裂解细胞,然后收集样品,再涂到另一个盘上裂解细胞,大概5个盘收集一次,换新的裂解液。收集到的样品差速离心后,用5k的超滤膜浓缩,这个膜Millipore生产的,样子很像离心管,可以将样品浓缩到20ul。再进行后面的试验就容易了。 |
肝脏线粒体很丰富,大概 1000–2000个/细胞,占细胞的总体积的1/5。HeLa细胞肯定比肝脏线粒体少多了。This paper estimated the number of "virtual" mitochondria (see below) in cells,from 5 different cell lines, which were derived from rat (skeletal muscle),mouse (fibroblast), rabbit (2 types of macrophage), and human (fibroblast).They found that the rat skeletal muscle cells had on average 140 "virtual",mitochondria. The overall counts ranged from ~90 mitochondria per cell in,one type of rabbit macrophage to ~700 in the other type of macrophage. |
线粒体数量和组织类型有很大关系,肝脏里面的线粒体很丰富,所以提取不困难,但是hela细胞可能就少的多,一般来说,培养细胞中提取线粒体大约至少需要2*107以上的细胞,也只能得到很少的一点线粒体,而这点线粒体中蛋白的含量也不是很高,所以需要反复提取,直至得到所需要的线粒体蛋白量,工作量比较大。 |
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