11个回答
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超声后有点沉淀是可以理解的，异源蛋白在BL21表达时由于表达量比较高，很可能是有一部分以可溶形式存在，还有一部分是包涵体的形式存在，超声后细胞碎片以及包涵体经离心后会沉下。如果你的包涵体比较多，这个沉淀的量还是很可观的。你的破壁条件是很常用的，一般为了保护机器都是要间歇性的超声，5/5用的很多。100次（16.7min）也足够了，但不同的菌株可能有不同，我以前做的几个菌株从10min到25min都有，但一般而言，如果你的蛋白不是是包涵体，建议超声时间不宜太长，机械剪切力的影响必须考虑进去。给你举个例子，我在做一个蛋白时超声时间设定在25min，吵完后12000rpm×10min结果什么东西都离不下来，但PAGE发现其实很多蛋白都已经降解了，整个条带像火箭电泳一样。超声时注意的因素也就那么几个。（1）首先是必须低温，可以采用冰浴的方法控制温度。（2）超声量不要太多，这个要自己去摸索，一定功率下的超声体积太大很容易破壁不完全。（3）菌体浓度不要太高，沉淀后的菌体重悬时控制好比例。超声时有泡沫出现的确不是件好事，很可能部分蛋白已经变性失活，但也并不像你想象的那样蛋白酶活就全没有了，可以测定一下还剩多少。超声时出现泡沫的控制方法我没有专门试过，但我想两个条件控制好应该会减轻这个现象。（1）控制超声时间，不要无意义的延长时间；（2）变辐杆下端深入液面以下多少要合适，太多太少都不行。其实超声条件的摸索还是一件比较简单的事情的，你可以取适量的菌液，设定功率，间隔不同的时间取样，革兰染色检测破碎效果，从而确定超声工艺，这是最简单的办法，也是最可行的办法。 |
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超声破碎时，一个是探头深入液面的长度，一般深入液面以下不长于0.5cm；一个是超声破碎菌液的体积和液体的表面积，液体的表面积太小而探头又很大，很容易起泡沫；功率400W适中，如果体积小的话，还可以降低下功率，延长工作时间即可。如果仍不凑效，那就采用merck的bugbuster裂解液吧，得到的蛋白一般不会在蛋白抽提的时候变性。 |
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超声后有点沉淀是可以理解的，异源蛋白在BL21表达时由于表达量比较高，很肯能是有一部分以可溶形式存在，还有一部分是包涵体的形式存在，超声后细胞碎片以及包涵体经离心后会沉下。如果你的包涵体比较多，这个沉淀的量还是很可观的。你的破壁条件是很常用的，一般为了保护机器都是要间歇性的超声，5/5用的很多。100次（16.7min）也足够了，但不同的菌株可能有不同，我以前做的几个菌株从10min到25min都有，但一般而言，如果你的蛋白不是是包涵体，建议超声时间不宜太长，机械剪切力的影响必须考虑进去。给你举个例子，我在做一个蛋白时超声时间设定在25min，吵完后12000rpm×10min结果什么东西都离不下来，但PAGE发现其实很多蛋白都已经降解了，整个条带像火箭电泳一样。超声时注意的因素也就那么几个。（1）首先是必须低温，可以采用冰浴的方法控制温度。（2）超声量不要太多，这个要自己去摸索，一定功率下的超声体积太大很容易破壁不完全。（3）菌体浓度不要太高，沉淀后的菌体重悬时控制好比例。超声时有泡沫出现的确不是件好事，很可能部分蛋白已经变性失活，但也并不像你想象的那样蛋白酶活就全没有了，可以测定一下还剩多少。超声时出现泡沫的控制方法我没有专门试过，但我想两个条件控制好应该会减轻这个现象。（1）控制超声时间，不要无意义的延长时间；（2）变辐杆下端深入液面以下多少要合适，太多太少都不行。其实超声条件的摸索还是一件比较简单的事情的，你可以取适量的菌液，设定功率，间隔不同的时间取样，革兰染色检测破碎效果，从而确定超声工艺，这是最简单的办法，也是最可行的办法。 |
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我以前超声破碎菌液也是特别容易起泡沫，后来调整好探头深入液面的位置就好多了，一般把探头深入到液面以下1/3的位置，超声1s停止10s,作用2min，然后隔15min再重复上面的操作，如此重复5次，这样间歇性的超声，效果还是不错的，尽管有点麻烦 |
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1、超声时要在冰浴下进行；2、超声功率与容器的内径有很大关系：内径小，所需功率也小，不易引起气泡；反之则可能致使蛋白变性；3、超声前加些蛋白酶抑制剂有利于保护目的蛋白的活性；4、超声时间5',间隙15-20'，总时间20 min左右 |
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超声的时候要注意不要把探头挨着管壁，还有就是要听超声时候的声音，一般清脆刺耳的就没问题，不然就可能处泡沫，还有就是一定要把探头伸到液面下，并且要稍微深一点 |
