2024-11-10 21:28:51

做一抗体片段的纯度分析,运用液相分析时不是太清楚相关情况

做一抗体片段的纯度分析(一类新药,没有标准品),参照药典三部上一般运用电泳和分子排阻HPLC法进行分析,电泳法没什么问题,就是在运用液相分析时不是太清楚相关情况:

1. 我们的样品里面有单体、二倍体和多倍体同时存在,实验的目的是要得出单体和二倍体的含量;

2. 我用常规的缓冲盐溶液进行分析时,根本得不出结果,峰形非常差;而将样品用6M盐酸胍处理后,便能得到理想的峰图和纯度结果。而药典上其他类型的单抗或者重组药物在用分子排阻HPLC法分析纯度时,一般的PBS缓冲液或者PBS含有1%异丙醇即可。

请问像我这样将样品用盐酸胍处理后进行HPLC纯度分析的方法是否可行,在进行新药申报时会不会遇到麻烦啊?因为6M盐酸胍时蛋白已经变性了;另外,缓冲盐中加入1%异丙醇的作用是什么,是否会使蛋白变性?


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3个回答

HP-SEC肯定是非变性条件,变性后dimer和monomer已经没有意义了,按道理纯化后的Fab不会有很乱的峰形,你的图是否能发过来看看?1% IPA是常见的,但很多时候有没有IPA,对最终峰形影响不大。另外,有可能和你的工艺有关,使用什么样的工艺做的表达和分离?如果只想知道共价聚集体的含量,理论上盐酸胍可能也可以,但据我知道,其他药物应该没这么做过。但你如何确定就一定没有疏水聚集体?或者说最终的质量标准中,是否只关心共价聚集体的含量?

2024-11-11 00:06:20

如果柱子没有问题,基本上是说明你的样品终究是存在大量的不同类型和不同聚集程度的聚集体。找一个BSA样品或丙球蛋白,用同样的方法分析一下,如果图很正常,你的方法就没有什么问题。我没做过细菌表达的ScFv,做过不少动物细胞的ScFv或Fab,HPLC得峰图都比较正常。当然,如果你认为目前的方法不适合你的品种,需要和中检院等沟通,选择不同的方法来进行纯度分析也是有可能的。

2024-11-11 00:22:09

看你说了很多,有一点我不大明白你的样品检测纯度,现在除了SEC-HPLC以外,别的方法检测的纯度有多少?是否和你用盐酸胍处理的SEC-HPLC类似?别的指标比如离子色谱或者等电点电泳做过吗?如果样品纯度肯定没有问题,再摸索一下方法,除了盐酸胍,也可以试一下尿素或者去垢剂。如果样品本身不纯,那就不是你方法的问题了。

2024-11-11 00:33:08

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