这个问题我也出现过一次，总结发现1.一抗浓度太高，用个两三次就好了；抗体不好（我的可以排除抗体不好）2.封闭不完全，时间不够3.洗脱时间次数不够。我当时的原因是一抗浓度太高

杂带太多了，背景也不好，建议从三方面找原因，一抗，二抗浓度是否过高，是否封闭好了，洗干净了没有。

五种情况，1、一抗浓度高了；2、封闭时间短了；3、孵育完二抗之后洗脱时间短了；4、你的蛋白有没有其他亚型；5、你的一抗来源本来就有问题，买之前说明书上面杂带多么。

一抗应该能用，可以把一抗浓度调低点试试。二抗浓度还行。其实配tbst主要是调ph值，盐酸用多少没具体测过。具体配方记不住，可以自己查。

你的抗体是不是多克隆的啊，多克隆容易出现多条条带，你只要找最明显的那条就行，再做的时候最好重新提蛋白，洗膜时间加长试试

改变一抗浓度，拍照也可以适当调一下